Экстракорпоральное Подготовка Изолированные Кишечные нейронов и глии от мышечно-кишечного сплетения взрослой мыши

Общая цель этой процедуры заключается в выделении функционально жизнеспособных нейронов и КИА из миентерального сплетения взрослой мыши. Это достигается путем предварительного покрытия стерильной поверхности клеточной культуры полилизином и ламинином. Вторым этапом является подготовка растворов и хирургической области для изоляции миентерального сплетения.

Далее удаляют из желудочно-кишечного тракта и изолируют нужный участок для создания продольного мышечного миентерального сплетения препаратом. Заключительным этапом является последовательное расщепление LMMP в коллагеназе и трипсине с последующим нанесением покрытия клеток на предварительно закодированные поверхности клеточной культуры. В конечном счете, электрофизиология, иммуноцитохимия и ПЦР одиночных клеток могут быть использованы для изучения эффектов кишечных нейронов, глии или взаимодействия между этими двумя типами клеток.

Демонстрировать процедуру будет доктор Триша Хар Смит, постдокторант во всех лабораториях, а помогать ей будет Джой Гомбе, кандидат наук во всех лабораториях. Основное преимущество этой методики перед существующими методиками заключается в том, что нейроны и глия происходят от взрослой мыши. Это позволяет получить полностью функционирующие нейроны и глию, которые потенциально могут быть получены от генетически модифицированных животных.

Хотя этот метод может дать представление об электрических свойствах нейронов. Он также может быть применен к другим методологиям, таким как иммуноцитохимия, ПЦР одиночных клеток и визуализация кальция в реальном времени. Начните эту процедуру с помещения усыпленной мыши в спинное лежачее положение на операционную поверхность.

Далее очистите кожу живота 70% этанолом. Затем поднимите его с помощью пары щипцов и вскройте брюшную полость ножницами, чтобы выявить внутренние органы пищеварения. После этого приподнимите участок подвздошной кишки, чтобы открыть брыжейку.

Удалите желудочно-кишечный тракт и прорежьте брыжейку ножницами. Затем аккуратно удалите и распутайте подвздошную и толстую кишку. Будьте осторожны, чтобы не вытащить брыжейку из подвздошной и толстой кишки после того, как кишечник будет распущен по всей длине.

Удалите подвздошную кишку, разрезав кишечник дистальнее желудка и проксимальнее слепой кишки. Эта процедура также может быть выполнена с тканью толстой кишки путем удаления толстой кишки от дистального к слепой кишке и проксимальному отделу анального отверстия. Далее разделите подвздошную кишку на три или более крупных кусочка.

Аккуратно втирайте раствор креба через кишечный срез до тех пор, пока все фекалии не будут удалены в отдельный контейнер для отходов. Поместите чистый срез в контейнер с маркировкой Krebs «чистый» и повторяйте процедуры до тех пор, пока не будет очищен весь подвздошный лад. Чтобы удалить ЛММП, разрежьте подвздошную кишку на двух-четыре сантиметровых небольших отрезка.

После этого поместите сегмент подвздошной кишки на пластиковый или стеклянный стержень. Подвздошная кишка должна плотно прилегать, но не расшатываться и не тугаться. Предотвратите вращение желудочно-кишечного тракта вокруг стержня, аккуратно прикрепив трубку к стержню большим пальцем.

Затем аккуратно удалите кусочки брыжейки, которые все еще прикреплены к желудочно-кишечному тракту, с помощью щипцов. После этого отделите LMMP от нижележащей круговой мышцы. Сначала аккуратно потирая край щипцов по всей линии, где крепилась брыжейка, сверху вниз

Впоследствии аккуратно создайте разрыв в продольной мышце. Затем аккуратно отденьте продольную мышцу с помощью ватной палочки, смоченной с крепами, начиная с верхней части промежутка, используя самый легкий горизонтальный удар, оказывая при этом очень легкое давление, пока продольная мышца не начнет отделяться от круглой мышцы. Проделайте это вниз по всей полосе вдоль брыжеечной точки прикрепления.

Затем аккуратно обработайте желудочно-кишечную трубку, двигаясь сверху вниз и обратно. Поскольку продольная мышца медленно отделяется от круговой мышцы по всему периметру трубки. По завершении LMMP естественным образом отделится от оставшейся желудочно-кишечной трубки.

Затем поместите полученную тонкую полоску продольной мышцы в стакан с надписью LMMP и повторите процедуры для всех сегментов в этой процедуре. Поместите ополаскиватель до сегментов LMMP в раствор для разложения. Затем ножницами нарежьте LMMP на мелкие кусочки.

Далее перевариваем их в течение 60 минут. В водяной бане с температурой 37 градусов Цельсия с помощью шейкера при этом слегка пузырится карбогеном. После того, как разложение будет завершено, соберите клетки путем центрифугирования в течение восьми минут при давлении 356 G в центрифуге, охлажденной до четырех градусов Цельсия.

Тем временем приготовьте 0,05% раствор трипсина в колпаке для клеточных культур, добавив один миллилитр подогретого 0,25% трипсина и четыре миллилитра подогретого HBSS в стерильную 50-миллилитровую пробирку для клеточной культуры. После центрифугирования выбросьте надосадочную жидкость, аккуратно удалите клеточную гранулу и поместите ее в чистую пробирку с пятью миллилитрами 0,05%-ного раствора триина. Далее переваривают клетки в 0,05%-ном растворе триина на водяной бане при температуре 37 градусов Цельсия с встряхиванием в течение семи минут, нейтрализуют триин 10 миллилитрами холодного промывочного материала.

После семи минут лечения трипсином, затем центрифугируйте клетки в течение восьми минут при давлении 356 g. Тем временем уравновесьте секцию стерилизованной сетки TX на стерильной 15-миллилитровой пробирке для клеточной культуры. После центрифугирования выбросьте надосадочную жидкость, аккуратно ресуспендируйте клеточную смесь, запустив ее в трех миллилитрах.

Полноценная нейронная среда. Чтобы избежать образования пузырьков воздуха, затем отфильтруйте клеточный раствор через сетку NYX в 15-миллилитровую чистую пробирку для клеточной культуры. Соберите клетки центрифугированием в течение восьми минут при 356 g.

После этого извлеките и выбросьте надосадочную жидкость. Повторно суспендируйте клетки в 1200 микролитрах полной нейронной среды. Затем аккуратно тируйте клетки с помощью пластикового наконечника для пипетки объемом один миллилитр.

Будьте осторожны, чтобы не создавать пузырьки воздуха в пипетке медленно и осторожно, пока большинство кусков не разобьется и клетки не будут взвешены в жидкости. Теперь добавьте 750 микролитров готового фильтрующего материала в каждую из 12 лунок, содержащих предварительно закодированную стеклянную крышку. Затем добавьте 100 микролитров рассчитанного клеточного раствора.

Инкубируйте нейроны в инкубаторе для клеточных культур при температуре 37 градусов Цельсия с изменением углекислого газа на 5%. Половина клеточных сред каждые два дня. Нейроны готовы к электрофизиологической записи через один-два дня в культуре.

Здесь представлена иммуногистохимическая характеристика кишечных нейронов. Леа изолировалась от мыши. Конфокальная микроскопия продольных мышц выявила специфическое для нейронов окрашивание бета-3 тубулина во всем препарате продольной мышцы подвздошной кишки у мыши.

И это клетки, выделенные из препаратов LMMP, которые содержат нейроны, положительно окрашенные на связывание с калами, и показанные здесь клетки глии Retin, которые были визуализированы с помощью специфичного для глии маркера GFAP. Тем не менее, при отсутствии первичного антитела окрашивание не наблюдалось. Здесь выделенные из мышиной продольной мышцы выделяются нейроны и глии, растущие в непосредственной близости друг от друга.

Конфокальные микроскопические изображения показывают, что зеленые нейроны и красные ggl легко растут рядом друг с другом и, по-видимому, взаимодействуют in vitro. На этом рисунке показана электрофизиология культивируемых энтеральных нейронов и CLIA в режиме текущего зажима. Все нейроны проявляли потенциалы действия при инжекции тока.

CLIA не имеют потенциалов действия, но проявляют большие электротонические потенциалы в ответ на инжекцию тока. Нейроны, культивируемые из подвздошной кишки мыши, представляют собой электрофизиологическую гетерогенную популяцию. В режиме токоизмерительного тока инжекция тока в 0,09 наноампер в нейроны приводит к возникновению потенциалов действия.

Отрицательные нейроны HP немедленно возвращаются к мембранному потенциалу покоя после стимуляции. В то время как HP положительные нейроны демонстрируют A HP после стимуляции, при которой потенциал мембраны покоя падает ниже базового уровня, прежде чем медленно вернуться к исходному значению. После освоения этой техники ее можно выполнить за четыре часа, если она выполнена правильно.

При попытке выполнить эту процедуру важно помнить о том, что стеклянная посуда и хирургические инструменты должны быть как можно более чистыми. Кроме того, аккуратно повторяйте и пузырите клетки и меняйте половину питательных сред для клеточных культур каждые два дня после этой процедуры. Такие методы, как электрофизиология и иммуноцитохимия, могут быть применены для того, чтобы ответить на дополнительные вопросы, например, как ионные каналы в кишечнике реагируют на медикаментозное лечение, а также узнать об экспрессии белков в нейронах и лиях, а также о том, как взаимодействие этих двух типов клеток изменяется под действием различных методов лечения после его развития.

Этот метод проложил путь исследователям в области нейробиологии к изучению основных функций невропатий и g-невропатий энтеральной нервной системы у генетически модифицированных животных. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как выделить нейроны и глию из TER-сплетения энтеральной нервной системы взрослой мыши.