Изоляция, культура и Визуализация человека плода поджелудочной кластеров клеток

Общая цель этой процедуры заключается в выделении кластеров клеток поджелудочной железы плода человека. Это достигается путем предварительной очистки и грубой рубки поджелудочной железы. Далее ткань поджелудочной железы переваривается коллагеназой.

Затем переваренные агрегаты ресуспендируются и помещаются в чашки Петри. Наконец, клетки помещают на девятиметровую матрицу HTB или инкубируют в виде агрегатов, и проводят эксперимент. В конечном счете, Р-Т--К-Р.

Западный анализ крови или иммунофлуоресцентная микроскопия используются для выявления изменений в экспрессии или локализации генов или белков. Применение этого метода распространяется и на терапию диабета первого типа, поскольку ряд критических биохимических процессов, которые регулируют переход клеток-предшественников поджелудочной железы человека в зрелые глюкозо-чувствительные клетки, секретирующие инсулин in vitro, остаются неизвестными. Как правило, люди, плохо знакомые с этим методом, испытывают трудности из-за неполного или чрезмерного пищеварения, что приводит к плохому формированию кластеров клеток поджелудочной железы плода.

Демонстрировать эту процедуру будет Лопес, техник из моей лаборатории: начать рассечение поджелудочной железы плода, аспирировать жидкость и перенести поджелудочную железу в 60-миллиметровую чашку с помощью щипцов без HBSS и удалить все видимые жир селезенки или соединительную ткань. Используйте около половины миллилитра HBSS для полоскания поджелудочной железы, прежде чем использовать щипцы, чтобы перенести ее в небольшой стерильный тигель и в ведро со льдом. Поместите тигель в держатель для центрифужной пробирки объемом 50 миллилитров и двумя парами ножниц энергично разрежьте поджелудочную железу в течение нескольких минут, удерживая одну сторону ножниц в неподвижном положении и перемещая только противоположные ручки, при этом упирая кончики ножниц в дно тигля на 1,5 миллилитров коллагеназы и измельченную поджелудочную железу в флакон, содержащий коллагеназу, который был приготовлен

Согласно текстовому протоколу и поместите в шейкер с водяной баней, установленный на 37 градусов Цельсия при 200 оборотах в минуту на срок до 10 минут. Не проверяйте чаще одного раза в течение первых пяти минут. Время переваривания зависит от качества ткани, так как может быть достаточно всего шести минут.

Конечная точка — это когда частицы мелкие и однородные. Для остановки активности коллагеназы. Наполните флакон холодным HBSS, затем положите на лед и дайте комочкам осесть в течение 10 минут.

После инкубации отсасывайте верхний слой, оставляя его чуть менее чем наполовину заполненным. Если нити ДНК присутствуют из-за гибели клеток в 100 микролитрах 10 мг на миллилитр, ДНК в раствор, то переносят клетки в коническую пробирку объемом 15 миллилитров и добавляют пять миллилитров центрифуги HBSS в течение пяти минут при 300 г. После аспирации HBSS повторно суспендируют клетки в пяти миллилитрах среды, содержащей глутамат RPMI 1640, 10% нормальной сыворотки человека, 10 миллимолярных куч, pH 7,2, пенициллин стрептомицин и грибковую зону.

Затем поместите клетки в 60-миллиметровую чашку Петри и инкубируйте клетки в суспензии при температуре 37 градусов Цельсия в течение 72 часов для агрегации и образования икх. После инкубационной пластины клетки на матрице человеческой клеточной линии HTB девять, как описано ранее, меняют питательную среду каждые 48 часов для проведения иммунофлуоресценции на адгезивных клетках. Снимаем питательную среду и промываем клетки PBS.

После однократной промывки клеток 10 миллилитрами PBS добавьте 4% PFA, чтобы зафиксировать клетки на 20 минут при комнатной температуре, а затем используйте PBS для промывки клеток дважды. Затем, после инкубации клеток с 0,2% триттона X 100 в PBS в течение 10 минут при комнатной температуре и двукратной промывки клеток PBS, инкубировать клетки в блокирующем буфере в течение одного часа, пипетировать 60 микролитров раствора первичного антитела на перфил, помещенный в герметичный контейнер. Затем снимите защитный колпачок с планшета 12 Well и промокните дополнительный блокирующий буфер, прежде чем поместить его поверх основной капли антител.

Инкубируйте образец в течение 90 минут при комнатной температуре. После трех промывок образцов поместите каплю флуоресцентных вторичных антител на кусочек параформы с PBS. Промойте образцы и промокните излишки PBS с помощью папиросной бумаги, прежде чем поместить их на каплю раствора антител.

Защитите образец от света и выдержите в течение одного часа при комнатной температуре после промывки образцов и промокания, как и раньше, добавьте каплю монтажного геля и переверните крышку на предметное стекло. С помощью аспирации удалите излишки монтажного геля и аккуратно просткните заднюю часть наконечника пипетки объемом 200 микролитров, чтобы удалить пузырьки воздуха. Дайте образцам высохнуть в течение 20 минут и исследуйте под флуоресцентным или конфокальным микроскопом.

Тщательная подготовка ИКК плода имеет решающее значение для успеха протокола, описанного в этом видео. Эта серия панелей иллюстрирует, как клетки обычно выглядят в определенные периоды после нанесения покрытия. Например, после очистки только что покрытые клеточными агрегатами они выглядят как небольшие, редкие прозрачные кластеры, которые содержат мало клеток.

По прошествии первых 24 часов многие клеточные кластеры становятся больше, а многочисленные мелкие кластеры остаются к 48 часам. Кластеры значительно расширились, но остаются асимметричными в течение 72 часов. ИКК должны быть прозрачными, относительно однородными по размеру и форме, и могут быть либо нанесены на матрицы, либо выращены в течение дополнительных 72 часов с использованием химических веществ или лекарств для создания эндокринных клеток поджелудочной железы или без них.

Эти рисунки показывают ряд часто используемых антител для оценки либо пролиферации ICC, либо дифференцировки в сторону эндодермы поджелудочной железы. Здесь iccc были нанесены на HTV 9, выращены в течение четырех дней и окрашены на PDX One, критический маркер развития поджелудочной железы. Несмотря на то, что мы обычно выполняем окрашивание ИКК in vitro, чаще всего ИКК человеческого плода пересаживают под почечную капсулу обнаженных мышей и позволяют им размножаться и дифференцироваться in vivo.

В этом примере залитые парафином срезы почек, содержащие трансплантированные икки, окрашивали маркером эпителиальных клеток цитокератином зеленого цвета и KI 67, показанным красным цветом, для оценки пролиферации клеток. В другом примере человеческий инсулин зеленого цвета и глюкагон красного цвета были обнаружены после трансплантации и созревания под почечной капсулой голой мыши. После того, как вы освоите эту технику, ее можно выполнить за 90 минут при правильном выполнении.

При проведении этой процедуры важно помнить, что каждая партия коллагеназы отличается и нуждается в эмпирической оптимизации. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как изолировать культуру и имидж. Кластеры клеток поджелудочной железы плода человека.