Изоляция, культура, и трансплантация мышечных сателлитных клеток

Выделение и культура чистой популяции покоящихся сателлитных клеток, мышц стволовых клеток населения, имеет важное значение для понимания мышечной биологии стволовых клеток и регенерации, а также трансплантации стволовых клеток для лечения в мышечной дистрофии и других дегенеративных заболеваний.

Общей целью этой процедуры является трансплантация очищенных, покоящихся сателлитных клеток скелетных мышц взрослых нейронов для лечения травм скелетных мышц. Это достигается путем сначала рассечения скелетных мышц у взрослых мышей и ферментативно переваривающих скелетных мышц, а затем сортировки неподвижных сателлитных клеток с помощью магнитного разделения шариков. Затем выделенные клетки расширяются на чашках для культур, покрытых коллагеном, и на заключительном этапе расширенные клетки in vitro вводятся в скелетные мышцы взрослых мышей, обработанные кардиоином.

В конечном счете, приживление и вклад расширенных сателлитных клеток in vitro в регенерацию мышечных волокон можно оценить с помощью xal-окрашивания. Привет, меня зовут суши ура. Я доцент Института стволовых клеток Университета Миннесоты.

Выделение центовых сателлитных клеток, которые представляют собой массовую популяцию стволовых клеток, имеет важное значение для понимания биологии мышечных стволовых клеток и регенерации, а также трансплантации стволовых клеток для терапии мышечных дистрофий, таких как массовые мышечные дистрофии Дюшенна. Основное преимущество этой методики перед существующими методами заключается в том, что наш метод является быстрым, экономичным и надежным методом очистки спокойных сателлитных клеток от рассеянной мышцы взрослой мыши. Демонстрационные процедуры будут проводиться доктором Рио Мото, постдоком Хаши и младшим научным сотрудником Йоко Асура в моих лабораториях.

Чтобы изолировать мононуклеарные клетки из скелетных мышц мыши, начните с щипкания, а затем разрезания кожи живота каждой усыпленной взрослой мыши в возрасте от трех до восьми недель. Отшелушите кожу в противоположных направлениях, чтобы полностью обнажить трицепсы и мышцы задней ноги, а затем обрежьте вдоль костей ног, чтобы удалить передние четырехглавые мышцы большеберцовой кости и трицепса. Переведите мышцы в ледяную, стерильную PBS в 10-сантиметровую пластину и смойте кровь.

Затем переложите мышцы на новую стерильную шестисантиметровую пластину. Далее под стереомикроскопом удалите соединительную ткань, кровеносные сосуды, нервные пучки, а также добавьте эпигенную ткань из мышц. Затем с помощью офтальмологических ножниц разрежьте и измельчите ткань в гладкую кашицу.

Стараясь не оставлять крупных кусков. Переложите измельченные мышцы в 50-миллилитровую трубку и переварите ткань в пяти миллилитрах раствора коллагеназы при температуре 37 градусов Цельсия. Через час с помощью шприца, оснащенного иглой 18 калибра, несколько раз протрите тканевую кашицу.

Чтобы гомогенизировать смесь, инкубируйте гомогенат еще 15 минут, а затем снова перемешайте смесь Чтобы диссоциировать суспензию на одну клеточную суспензию, добавьте до 50 миллилитров среды и перемешайте клеточный раствор. Затем отфильтруйте клеточную суспензию через сетчатое фильтр 70 микрон в новую 50-миллилитровую пробирку для сокола. Подсчитайте собранные клетки, а затем уменьшите клеточную суспензию после промывки клеток, повторно суспендируйте гранулу в 200 микролитрах среды, а затем перенесите клетки в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 миллилитра, чтобы окрашивать и разделять клетки.

Поместите микроцентрифужную пробирку на лед, а затем инкубируйте клетки с одним микролитром каждого из перечисленных антител. Через 30 минут промойте клетки в одном миллилитре среды два раза. Затем повторно суспендируйте гранулу в 200 микролитрах среды и инкубируйте клетки 10 микролитров анти-ПЭ магнитных шариков на льду.

Еще через 30 минут промойте клетки в одном миллилитре максимального буфера два раза и повторно суспендируйте гранулу в одном миллилитре буфера. Затем поместите колонку LD в магнит и промойте колонку 1,5 миллилитрами максимального буфера. Дозируйте клеточную суспензию на колонку, собирая отрицательный поток ПЭ через фракцию в пробирку объемом 1,5 миллилитров.

Затем раскрутите отрицательную фракцию ПЭ и повторно суспендируйте гранулу в 100 микролитрах среды. Теперь инкубируйте клетки в пяти микролитрах антиамериканских магнитных шариков IgG на льду, а затем через 30 минут промойте клетки в одном миллилитре максимального буфера два раза, суспендируя гранулу в 500 микролитрах буфера. Затем поместите колонку MS на магнит и промойте ее одним миллилитром максимального буфера.

Затем распределите ячейки по колонке, отбрасывая альфа-семь отрицательных потоков через фракцию. Промойте колонку два раза одним миллилитром максимального буфера, а затем снимите ее с магнита. Затем промывайте один миллилитр максимального буфера через колонку с помощью поршня, чтобы вымыть семь положительных клеток интегрина, меченного магнитом, в свежую микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 миллилитров.

Затем, после вращения клеточной суспензии, повторно суспендировать очищенные клетки в среде миобласта. Наконец, поместите клетки на шестисантиметровую пластину, покрытую матригелем, содержащую пять миллилитров среды миобласта. Для поддержания клеточной культуры подкармливайте клетки через день миобластами среднего роста.

Проявляют небольшую круглую форму и экспрессируют myo D в своих ядрах. Когда вы будете готовы начать слияние клеток, промойте клетки один раз PBS, а затем попробуйте анизировать их в инкубаторе с 5% CO2 при температуре 37 градусов Цельсия. Через три минуты соберите диссоциированные клетки в среде миобласта, замедлите ресс клеток, суспендируя гранулу в среде миобласта, и переведите клетки на новые пластины, покрытые матригелем.

Для дифференцировки клеточной культуры кормите клетки через день средой для дифференцировки. Через сутки миобласты выйдут из клеточного цикла и подвергнутся дифференцировке в тяжелые миозины или MHC-положительные миоциты. К третьему-пятому дню клетки сливаются друг с другом и образуют многоядерные миотрубки.

За 24 часа до трансплантации миобласта сбрейте волосы вокруг передней части большеберцовой кости или мышцы ТА двухмесячной мыши. Затем с помощью инсулинового шприца 31 калибра введите в мышцу 10 микромолей кардиоина. На следующий день отделите пролиферирующие миобласты от покрытых матригелем пластин трипсином, как только что было показано, и раскрутите диссоциированные клетки, ресуспендируйте один раз от 10 до шестой части клеток в 50 микролитрах среды.

Затем загрузите клетки в инсулиновый шприц 31 калибра и пересадите клетки внутримышечно животному-реципиенту для регенерации передних мышц ЧМТ. Через одну-четыре недели после инъекции соберите мышцы ТА для гистологического анализа. Свежевыделенные пассивные сателлитные клетки имеют небольшую круглую форму, и более 90% этих клеток экспрессируют PAC 7 в качестве определяющего маркера.

Расширенные миобласты ex vivo могут быть использованы для экспериментов по внутримышечному введению клеток с целью изучения вклада миобластов в регенерацию мышечных волокон и самообновление клеток-сателлитов. При культивировании в дифференцировочной среде миобласты выходят из клеточного цикла, сливаются друг с другом и превращаются в многоядерные миопробирки, экспрессирующие тяжелую цепь миозина через несколько дней или несколько месяцев после трансплантации. Бета-галакто-положительные донорские клетки, которые включают в себя пролиферирующие миобласты, самообновляющиеся сателлитные клетки и вновь образованные мышечные волокна, могут быть обнаружены в поврежденной сердечно-сосудистой мышце после каждого развития.

Этот метод проложил путь для исследователей в области мышечных стволовых клеток и мышечного происхождения для изучения трансплантации стволовых клеток при мышечной дистрофии. Меня зовут Йоко. Я Норио.Спасибо.

Спасибо за просмотр.