Ортотопическая мышиной модели человеческого рака простаты Метастазы

Это ортотопической модели рака предстательной железы человека позволяет для количественного определения размера опухоли, циркулирующих опухолевых клеток и образование различных метастазов в легких. Как клетки должны бежать первичный орган, попадает в кровь, и имплантировать в дополнительном сайте, эта модель эффективно повторяет сценарий в организме человека.

Общая цель данного эксперимента заключается в количественной оценке размера первичной опухоли, образования метастазов в легких и количества циркулирующих опухолевых клеток в мышиной модели рака предстательной железы человека. Это достигается путем прямой имплантации клеток рака предстательной железы человека в вентральную долю предстательной железы мыши-бабси-атимика. После того, как опухоли развились, бедренные кости и сердечная кровь удаляются у животного, что позволяет идентифицировать циркулирующие опухолевые клетки.

Наконец, первичные опухоли и легкие удаляются для анализа. В конечном итоге можно измерить изменения размера, веса и молекулярных характеристик первичной опухоли, а также образование метастазов в легких. Основное преимущество этого метода по сравнению с другими методами, такими как вправление хвостовой вены или межсердечная инъекция, заключается в том, что с помощью этого метода можно измерить полную степень метастазирования от образования первичной экстравазации опухоли и выживаемости в кровотоке до прихода и образования вторичного метастаза в новом месте.

Применение этой методики связано с лечением метастазов рака предстательной железы человека. Мы использовали эту модель для проверки эффектов нескольких низкомолекулярных терапевтических средств на ингибирование метастазирования рака предстательной железы человека. Кроме того, модель может быть использована для валидации потенциальных терапевтических мишеней для ингибирования метастазирования рака предстательной железы человека с использованием стерильных ватных тампонов и бетадина для скрабирования нижней части брюшной полости обезболенной шести-восьминедельной мыши.

Далее промокните участок спиртовой салфеткой, а затем протрите животное раствором Бетадина. Дав области высохнуть, с помощью заточенных стерильных хирургических ножниц сделайте разрез живота с низким средним уровнем живота в три-четыре миллиметра. Затем с помощью щипцов аккуратно приподнять мочевой пузырь, не двигая никакими другими органами или мышцами, и определить вентральную долю простаты, расположенную непосредственно под мочевым пузырем.

Теперь введите интересующую популяцию опухолевых клеток с помощью шприца объемом 0,5 куб. см, оснащенного иглой 28 с половиной калибра, в вентральную предстательную железу, сводя к минимуму утечку и гарантируя, что в ткани будет наблюдаться небольшой пузырь. Затем замените мочевой пузырь и используйте рассасывающиеся швы из моноволокна Викрил 4.0, чтобы закрыть мышечный слой по простой прерывистой схеме. Закройте слой кожи стерильными девятимиллиметровыми скобами.

Через четыре-шесть недель опухоли становятся визуально заметными или могут быть пальпированы после эвтаназии. Хирургическими ножницами разрежьте горизонтально прямо под грудной клеткой, затем вертикально до подмышечной впадины, чтобы обнажить сердце, удалите кровь у животного с помощью терминальной пункции сердца с помощью хирургических ножниц, разрежьте трахею, а затем удалите легкие и немедленно поместите легкие в тканевую кассету, а затем в контейнер, содержащий 10% формалина. Далее по отдельности разрежьте все кровеносные сосуды, прикрепленные к первичной опухоли простаты, следя за тем, чтобы к ней не прикрепились дополнительные органы, запишите вес и размер опухоли.

Затем сразу же щелкайте, замораживайте ткань в жидком азоте или поместите ткань в тканевую кассету, а затем в емкость, содержащую 10% формина. Наконец, с помощью хирургических ножниц обнажите тазобедренные и коленные суставы. Затем отсоедините ноги, стараясь сохранить бедренную кость в целости и сохранности, прежде чем поместить их в стерильный физиологический раствор.

На этом первом рисунке показаны изменения массы тела и потребления пищи мышами через шесть недель после инокуляции опухоли. Обратите внимание, что из-за анестезии наблюдается небольшое снижение массы тела и потребления пищи в день операции. В ходе эксперимента масса тела и потребление пищи медленно увеличиваются после операции, а затем начинают снижаться к концу эксперимента.

Когда опухолевая нагрузка достигает критического уровня на этих графиках, отображаются репрезентативные размеры опухоли. Размеры отдельных опухолей варьируются, но в среднем достигаются опухоли весом примерно в один грамм и размером в один сантиметр в кубе, как показано на рисунке. Здесь важно учитывать изменения веса и размера опухоли, которые происходят между четырьмя и шестью неделями.

При планировании конечной точки эксперимента в этом репрезентативном эксперименте в течение последних двух недель средняя масса опухоли увеличилась в 2,7 раза, а размер опухоли резко вырос в 1,9 раза. Влияние на экспериментальные результаты может привести к тому, что на этом графике можно наблюдать изменения в общем количестве метастатических клеток на легкие и вскрытие мышей через четыре недели по сравнению с шестью неделями. У мышей, умерщвленных через четыре недели, метастатическое развитие не наблюдалось, в то время как у мышей через шесть недель после инокуляции опухоли наблюдались метастатические клетки у всех мышей.

Проведена дальнейшая оценка, подчеркивающая важность проведения вскрытия мышей на поздней стадии, чтобы убедиться в возникновении метастазирования. Это время может варьироваться в зависимости от клеточной линии или генных модификаций. Количество метастазов может быть количественно определено тремя различными способами.

Например, общее количество GFP-положительных клеток рака предстательной железы человека можно просто подсчитать с помощью иммуногистохимического окрашивания на GFP или с помощью окрашивания h и e, как на этих изображениях, где отдельная клетка с 40-кратной величиной выделена стрелкой. Обратите внимание, что коричневое окрашивание в области GFP окрашивает легкие и большие отдельные ядра. Еще один способ количественной оценки количества метастазов — рассмотреть количество мест, где присутствуют метастатические отложения.

Например, на этом изображении с 10-кратной звездной величиной можно наблюдать несколько локусов с различным номером клеток, каждый из которых выделен стрелкой, а также один локус с тремя различными клетками. Наконец, количество различных метастазов, определяемое четко связанной группой клеток, показывающей пять или более GFP-положительных клеток рака предстательной железы человека, также может быть количественно определено, как показано на этом изображении, где одно метастатическое отложение из 10 клеток показано на этих последних трех графиках, репрезентативных экспериментах QR TPCR R, измеряющих экспрессию трех генов, представляющих интерес в метастатической матрице прогрессирования металлопротеиназы второго типа. Показаны матриксная металлопротеиназа 9-го типа и белок теплового шока 27 в отдельных образцах опухолей, собранных у мышей через шесть недель. При первоначальной разработке этой техники важно работать с вашим животноводческим учреждением и ветеринарным персоналом, чтобы правильно проводить анестезию, обезболивающие препараты и свести к минимуму хирургическое давление.