3.14: Drosophila melanogaster Сбор и подготовка эмбрионов и личинок

Эмбрионами и личинками Drosophila melanogaster легко манипулировать, а их развитие направляется механизмами, существующими в других организмах, в том числе у млекопитающих. Обучение сбору и подготовке эмбрионов и личинок является предварительным шагом во многих экспериментальных процессах от поведенческой до биологии развития. В этом видео будут освещены стандартные методы сбора и заготовки эмбрионов и личинок дрозофилы, основные процедуры в использовании этого универсального модельного организма.

Изучение эмбриона дрозофилы дало глубокое понимание того, как гены регулируют развитие, начиная с мРНК, которая экспрессируется в виде градиента в ооците, и заканчивая генами, формирующими передний и задний сегментированный план тела. Некоторые из этих генов, такие как гомеобоксные гены, высоко консервативны между этим насекомым и млекопитающими.

Сердечный характер эмбрионов дрозофилы позволяет им выдерживать воздействие суровых условий окружающей среды и химических веществ, что делает их чрезвычайно практичными для изучения.

После оплодотворения одна самка мухи может отложить до 100 эмбрионов в сутки, из которых через 12-15 часов вылупятся личинки.

Для того чтобы манипулировать эмбрионами дрозофилы, их сначала необходимо собрать.

Эмбрионы собираются в камерах для яйцекладки, которые часто называют «чашками для яйцекладки».

Чтобы собрать чашку для кладки, сначала проделайте отверстия или вырежьте часть емкости и накройте ее пористым материалом, чтобы обеспечить вентиляцию. Затем достаньте агаровую пластину из яблочного или виноградного сока, смажьте ее дрожжевой пастой и процарапайте пластины в центре. Наличие дрожжевой пасты будет индуцировать яйцекладку.

Быстро добавьте мух в камеру для яйцекладки, переверните камеру так, чтобы пластина оказалась внизу, и дайте ей инкубироваться. По истечении нужного времени инкубации переверните яйцевую камеру и несколько раз постучите ею по столешнице. Мухи падают на дно и ненадолго теряют ориентацию. Быстро замените старую агаровую пластину на свежую тарелку, прослоенную дрожжевой пастой. Для приобретения наиболее возрастных эмбрионов меняйте пластины каждые 1-3 часа.

На пластинах будут сотни эмбрионов, особенно рядом с царапинами и дрожжами.

20 мух каждого пола должны производить 100-200 эмбрионов в час. Теперь эмбрионы можно собирать.

Инструментами, необходимыми для сбора эмбрионов, являются ситечко или сито, которое может сильно различаться по размеру и сложности, кисть и дистиллированная вода.

Сначала разрыхлите зародыши, погрузив пластину в дистиллированную воду, аккуратно протирая поверхность кистью. Далее отфильтруйте жидкость, вылив смесь в сито. Промойте эмбрионы водой.

Полоскание часто сопровождается дехорионацией ? удаление твердой наружной оболочки эмбриона, или хориона.

Дехорионация может быть выполнена вручную путем вскрытия эмбриона из оболочки хориона. В качестве альтернативы эмбрионы могут быть помещены в 50% отбеливатель. Для растворения хориона требуется 2-10 минут, что отмечается по исчезновению спинных придатков. Тщательно промойте дистиллированной водой, чтобы убедиться, что голый эмбрион не поврежден отбеливателем. Дехорионация является предпосылкой для таких методов, как микроинъекция и визуализация живых клеток.

Теперь, когда вы получили представление о биологии, сборе и сборе эмбрионов, давайте перейдем к следующему этапу жизненного цикла дрозофилы: личинкам.

Личинки дрозофилы имеют три стадии «инстарии», или линьки. Первый возраст длится один день, второй – еще один день, а третий – еще два дня. Личинки первого и второго возраста обнаруживаются в пище флакона через 1-3 дня после выкладки креста. На 4-й день личинки третьего возраста мигрируют вверх или «блуждают» вверх по стенкам контейнера, где они в конечном итоге образуют коконы, называемые куколками.

Личинки часто используются для экспериментов из-за их имагинальных дисков. Имагинальные диски являются частично развитыми органами, которые, как известно, становятся целыми частями взрослой мухи. Например, имагинальный диск глаза станет взрослым глазом, антенные диски станут антеннами, а имагинальные диски крыльев станут крыльями. Изучение имагинальных дисков привело к важным открытиям у дрозофил, таким как роль генов гомеобокса в формировании паттернов.

Сбор личинок проще, чем сбор эмбрионов, поскольку не требует переноса мух в специальные жилища.

Отдельные личинки можно удалить с помощью пинцета или шпателя. При сборе большого количества личинок на ранних стадиях вы можете использовать альтернативный метод сбора с использованием раствора сахарозы, который является более плотным, чем личинки, и заставляет их плавать.

Добавьте во флакон раствор сахарозы, который поднимает личинок наверх. Вытесните корм, поместив флакон на вращатель. Затем удалите личинки с помощью щетки или пипетки и соберите урожай для экспериментов.

Теперь, когда мы рассмотрели методы сбора и сбора эмбрионов и личинок, давайте посмотрим, как применять их в экспериментах.

Поскольку личинки дрозофилы подвижны, их можно использовать для поведенческих экспериментов.

Здесь вы видите «ползучий анализ», который используется для оценки локомоторного поведения дрозофилы в определенных условиях. Анализ на ползании измеряет расстояние, которое проходит личинка, чтобы наблюдать за влиянием препарата на двигательную функцию. Собранные личинки погружают в раствор сахарозы с лекарственным препаратом, который, по прогнозам, может препятствовать моторике.

Микроинъекция — это процедура создания генетически модифицированных плодовых мушек, известных как трансгенные мутанты, путем вставки индивидуального генетического материала в виде кольцевой плазмиды ДНК.

Эти эмбрионы дехорионизируются путем физического скручивания их на двусторонней ленте, чтобы химикаты не повредили их. Затем эмбрионам можно вводить плазмиды, которые кодируют белки, такие как тубулин, слитые с флуоресцентными репортерными белками, такими как GFP. Затем можно провести эксперименты для визуализации клеточных процессов, таких как митоз от установленных трансгенных линий мух.

Эмбрионы могут быть использованы для визуализации наличия транскриптов с помощью флуоресцентной гибридизации in situ.

В этом эксперименте целые эмбрионы наблюдаются на наличие желаемого транскрипта мРНК с помощью флуоресцентной микроскопии. Эмбрионы фиксируются с помощью двухфазного раствора, который дехорионаты, а значит, подготавливает эмбрион к окрашиванию. Голые эмбрионы находятся на нижнем слое. После иммунофлуоресцентного окрашивания присутствие нужного белка можно увидеть с помощью флуоресцентной микроскопии.

Вы только что посмотрели видео о сборе и подготовке эмбрионов и личинок JoVE. Мы рассмотрели сбор, сбор и подготовку эмбрионов и личинок, а также некоторые важные приложения, применяемые к организмам на ранних стадиях. Спасибо за просмотр!