Один мышь, двух культур: Выделение и культивирование взрослых нервных стволовых клеток из двух Нейрогенные зон отдельных мышей

Общей целью этой процедуры является одновременное получение культур нейральных клеток-предшественников в виде либо адгезивных монослоев, либо нейросфер из субвентрикулярной зоны и зубчатой извилины отдельных взрослых мышей. Это достигается путем предварительного удаления мозга отдельных взрослых мышей. Вторым шагом является микродиссекция субжелудочковой зоны и зубчатых областей извилин

Далее ткань диссоциируется в одноклеточную суспензию. Последним шагом является культивирование клеток-предшественников либо в виде адгезивных монослоев, либо в виде нейросфер. В конечном счете, анализ нейросферы и адгезивная монослойная культуральная система являются ценными инструментами для определения потенциала пролиферации или дифференцировки в взрослых нейральных стволовых клетках.

Этот метод in vitro позволяет нам ответить на несколько очень интересных вопросов в области нейрогенеза у взрослых. С его помощью мы можем смотреть на клетки отдельных животных и сравнивать их, и это представляет интерес в контексте рассмотрения индивидуальных различий или, например, различий между отдельными трансгенными или нокаутирующими масками по сравнению с их контролем. Тара Уокер, старший научный сотрудник моей группы, представила этот метод «Перед вскрытием мозга».

Подготовьте огонь отполированными пипетками со средними и мелкими кабанами, вращая стеклянные пастбищные пипетки в пламени до тех пор, пока края не станут округлыми. Затем простерилизовать их в автоклаве. Сначала перенесите мозг в 10-сантиметровую пластиковую чашку Петри, содержащую PBS.

Поместите чашку Петри с мозгом под препарирующий микроскоп при малом увеличении так, чтобы мозг располагался на ее вентральной поверхности. Впоследствии с помощью тонких изогнутых щипцов удалите обонятельные луковицы, удерживая мозжечок. Затем поверните мозг на дорсальную сторону.

Сделайте корональный разрез через мозг на уровне зрительного хиазма скальпелем для микродиссекции СВЗ. Приложите ростральную часть мозга к чашке так, чтобы поверхность среза коронки была обращена вверх. При большем увеличении снимите и выбросьте перегородку.

Затем рассеките SVZ, который представляет собой тонкий слой ткани, окружающий желудочек, поместив кончик одного лезвия тонко изогнутых щипцов в боковой угол бокового желудочка. Непосредственно под мозолистым телом и другой лопастью, примерно на один миллиметр вглубь тканей, непосредственно прилегающих к желудочку. Надавите на щипцы по направлению к основанию чашки и к вентральной поверхности желудочка, чтобы удалить небольшой треугольный кусочек ткани.

После этого препарированный СВЗ поместить в чашку Петри на льду для микродиссекции места ДЭГ, избалованной части мозга в чашке Петри и разрезать вдоль продольной щели с помощью скальпеля под микроскопом для вскрытия. Удалите мозжечок и головной мозг с красителем. Перефокусируйте микроскоп так, чтобы теперь были видны границы вокруг ДГ.

Чтобы снять ДГ, вставьте кончик иглы 27 калибра и проведите вдоль границы между ДГ и рогом аминь. Затем освободите ДГ от окружающих тканей с помощью тонких щипцов для диссоциации тканей СВЗ. Измельчите ткань с помощью лезвия скальпеля в течение минуты, пока не останется крупных кусков.

Затем ресус. Суспензируйте фарш одним миллилитром Prewarm 0,05%трипс в ЭДТА. После этого переложите его в 15-миллилитровую пробирку и выдержите в течение семи минут на водяной бане, установленной на 37 градусов Цельсия.

Чтобы остановить ферментативную реакцию, добавьте один миллилитр ингибитора трипсина, содержащего ДНК лебедя, и перемешайте содержимое, щелкнув пробиркой. Далее окатывают суспензию центрифугированием при 300 G в течение пяти минут и оставляют рубец. После этого сеннет ресуспендируют гранулы в одном миллилитре питательной среды и связывают гли.

Пипетирование вверх и вниз примерно от семи до 10 раз с помощью пипетки P 1000. Затем добавьте питательную среду до общего объема пять миллилитров и пропустите клеточную суспензию через сито 40 микрометров, чтобы удалить мусор и несвязанные тканевые комки. Затем центрифугируйте его при давлении 300 G в течение пяти минут.

Откажитесь от супината и реуса. Полученную гранулу суспензировать в 200 микролитрах питательной среды для диссоциации тканей ДГ. Измельчите салфетку с помощью лезвия скальпеля в течение примерно одной минуты, пока не останутся крупные кусочки.

Далее переложите салфетку фарша в предварительно разогретую смесь ферментов PDD. Инкубируйте его в течение 20 минут при температуре 37 градусов Цельсия и перемешивайте, переворачивая трубку каждые три-пять минут. Затем диссоциируйте ткань механическим способом, осторожно проведя ее пипеткой вверх и вниз 10 раз с помощью пастбищной пипетки среднего диаметра, отполированной огнем, затем инкубируйте еще 10 минут при температуре 37 градусов Цельсия и перемешивайте, переворачивая трубку каждые три-пять минут. Дальнейший.

Механически диссоциируйте ткань, аккуратно пипетируя ее вверх и вниз 10 раз с помощью небольшой пастбищной пипетки, отполированной кабаньим огнем. После этого центрифугируйте его при давлении 130 г в течение пяти минут. Впоследствии удалите супинат и повторно суспендируйте гранулу в одном миллилитре буферного раствора.

Вносят до 10 миллилитров с буферным раствором. После центрифугирования при 130 GS в течение пяти минут. Удалите надосадочную жидкость S и повторно суспендируйте гранулу в пяти миллилитрах по 20% на звонок.

Затем центрифугируйте его при давлении 450 GS в течение 15 минут. Извлеките снац и снова суспендируйте гранулу в 10 миллилитрах буфера. Наконец, центрифугируйте при 130 GS в течение пяти минут и повторно суспендируйте гранулу в 200 микролитрах питательной среды для адгезивных культур, наложите 200 микролитров клеток в каждую лунку A PDL Lamin ENC с покрытием 96 лунок для спиральных культур, разбавьте его с ростом, средним до 20 миллилитров и наложите 200 микролитров на лунку на 96-луночный планшет без покрытия, затем инкубируйте при 37 градусах Цельсия с 5% CO2 через 6-12 лунок дней подсчитывают и измеряют диаметр нейросфер с помощью IP-гради, установленного на вертикальном световом микроскопе.

На этом рисунке показано, что клетки-предшественники взрослых мышей могут быть культивированы как адгезивные монослойные культуры или как нейросферы в SVZ и dg. Значительно больше нейросфер генерируется из SVZ по сравнению с DG отдельных мышей, а клетки-предшественники SVZ и DG также по-разному реагируют на деполяризацию in vitro, что подтверждает долгосрочную потенциацию. Показано, что нейросферы расширились на 10 проходов.

Нейросферы могут быть дифференцированы на бета-три тубулин-позитивных нейрона, как показано красным цветом, GFAP-положительные астроциты — зеленым, O — четыре положительных олигодендроцита — красным цветом и отображены два AB-положительных нейрона красным цветом. Могут быть выполнены и другие методы, такие как упаковка клеток или нейросфер в течение нескольких поколений или дифференцировка нейросфер с последующим гистологическим анализом. Это поможет ответить на дальнейшие вопросы, такие как многопотенциальная и долгосрочная перспективность.