Магнитные Пинцет для измерения Twist и крутящий момент

Общая цель этого эксперимента состоит в том, чтобы напрямую измерить крутильные деформации или изменения в закручивании двухцепочечных молекул ДНК на уровне одной молекулы. Это достигается с помощью двух анализов в первом анализе, называемых свободно орбитальным магнитным пинцетом или ударным. Одна функционализированная молекула ДНК привязана между магнитным шариком и стеклянной поверхностью.

В то время как магнит цилиндрической формы оказывает действие, растягивающее ДНК, угловое положение бусин ограничено только привязанной ДНК, а не магнитом, что позволяет вращению бусины, как показано красной стрелкой, сообщать об изменениях в закручивании ДНК и тепловых флуктуациях вращения бусины. Его положение XY лежать на круглом кольце или бублике. Преобразование этого положения XY в угол вращения позволяет отслеживать изменения в закручивании привязанной ДНК во втором связанном анализе, называемом магнитным моментным пинцетом, или боковой магнит MTTA, который добавляется к основному цилиндрическому магниту для ограничения углового движения шариков.

При такой конфигурации магнита внешние крутящие моменты могут быть приложены к привязанной молекуле ДНК путем простого вращения магнитной сборки, измерения отклонения углового положения бусин после приложения нескольких оборотов по сравнению с ее исходной конфигурацией, расслабленной на кручение, вместе с калибровкой жесткости магнитной ловушки, которая ограничивает бусины. угловое движение позволяет количественно оценить накопление крутящего момента в ДНК. Основное преимущество использования шрифта и МТТ перед обычными магнитными пинцетами заключается в том, что мы можем напрямую измерять крутящий момент и изменения в закручивании нуклеиновых кислот. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы о механике ДНК и РНК, позволяя нам составить карту их реакции на внешние силы и крутящие моменты.

Применение этого метода распространяется и на исследование взаимодействий ДНК с белками. Например, белки, отвечающие за репарацию ДНК, хранение или транскрипцию Визуальная демонстрация этого метода иллюстрирует, насколько легко можно модифицировать обычный магнитный пинцет, чтобы придать ему новые возможности. Установка, используемая для следующих экспериментов, основана на обычной установке магнитного пинцета.

В его центре находится проточная ячейка, подсвеченная сверху светодиодом и визуализируемая через объектив микроскопа и ПЗС-камеру снизу. Над проточной ячейкой находится магнитная головка, которую можно перемещать вверх и вниз, а также вращать с помощью двигателей, управляемых компьютером. Изображения с ПЗС-камеры анализируются в режиме реального времени специальным программным обеспечением для просмотра в лаборатории для определения положения X, Y и Z привязанных бусин ДНК.

Индивидуальное программное обеспечение для просмотра лабораторных работ предоставляется авторами по запросу. После подготовки проточной ячейки с привязанными магнитными шариками ДНК устанавливаем ее на обычный магнитный пинцет и выбираем как поверхность, обездвиженную для эталонного шарика, так и бусину, к которой привязана отдельная молекула ДНК нужной длины. Настройки можно перевести в режим шрифта.

Начните с ручного откручивания всей магнитной головки, которая удерживает магнит для обычной конфигурации пинцета. Замените его магнитной головкой, которая удерживает цилиндрический магнит для шрифта. При размещении цилиндрического магнита, используемого для F, в магнитной головке, убедитесь, что выбранный трос ДНК находится в поле зрения.

Самым сложным аспектом этой процедуры является правильное выравнивание магнитов для геометрии формы. Хорошая юстировка достигается путем систематического перемещения магнитов и проверки юстировки после каждого шага, что мы и продемонстрируем. Теперь выполните выравнивание магнита по курсу шрифта, используя позиционные ступени, чтобы вручную переместить магниты в программном обеспечении для просмотра лабораторных работ.

Нажмите на кнопку записи, чтобы измерить колебания или отклонения положения по оси XY. Записанные следы отображаются на экране в режиме реального времени и сохраняются в виде текстовых файлов, содержащих информацию о положении по осям X, Y, Z. Если отклонения XY следуют по дуге, как показано здесь, цилиндрический магнит не выровнен должным образом, продолжайте перемещать цилиндрический магнит в соответствующем направлении и проводить измерения до тех пор, пока колебания XY не очертят полную круговую структуру, которая указывает на то, что выравнивание курса достигнуто. Следующий.

При необходимости для дальнейших экспериментов выполните точное выравнивание шрифта с помощью автоматизированного столика с высоким разрешением для перемещения ячейки потока, выравнивая цилиндрический магнит в пределах примерно 10 микрон от валика. Затем, как и раньше, запишите экскурсии XY. Продолжайте перемещать сцену и записывать экскурсии до тех пор, пока колебания на круглом кольце не станут почти равномерными.

Чтобы проверить окончательное выравнивание, используйте скрипт MATLAB, который можно получить от авторов по запросу, чтобы построить график колебаний гистограммы или термограммы и проверить ее на однородность. Чтобы измерить крутящий момент ДНК, снимите цилиндрический магнит, который используется для шрифта, и замените его цилиндрическим магнитом и постоянным боковым магнитом. Для МТТ убедитесь, что выбранный трос ДНК остается в поле зрения.

Введите количество и скорость магнитных витков на соответствующей панели управляющего программного обеспечения для просмотра лабораторных работ. Здесь. Количество оборотов установлено равным пяти, а скорость установлена на 0,1 герца. Это приведет к медленному вращению магнитов во время измерения.

Далее в matlab используйте скрипт углового слежения, основанный на мониторинге положения XY, который предоставляется у автора по запросу. Появится график, отображающий угловые колебания в зависимости от времени, тета Т. После того, как все будет настроено в лабораторном режиме, нажмите кнопку записи.

Следы будут отображаться в режиме реального времени, как и раньше. В matlab с помощью скрипта MATLAB можно построить графики угла тета T и высоты бусины Z трассы T на экране с гауссовской аппроксимацией по сигналу угла для определения стандартного отклонения угловых колебаний. Сигма тета.

Этот скрипт напрямую определяет жесткость крутильной ловушки по дисперсии угловых колебаний. Сигма тета в квадрате в радианах. Используя приведенную здесь формулу, обратите внимание, что в МТТ типично достижение жесткости вращательной ловушки от 10 до 1000 пико ньютон нанометров на радиан, что намного ниже, чем в обычном магнитном пинцете.

Здесь, например, мы определили жесткость вращательной ловушки как около 52 нанометров на радиан. Жесткость магнитного моментного пинцета при вращательной ловушке по сравнению с обычными магнитными пинцетами делает его пригодным для измерения крутящего момента одной молекулы, но также означает, что максимальный крутящий момент, который может быть приложен, снижается. Это означает, что MTT не может уравновешивать крутящие моменты сопротивления, вызванные быстрым вращением.

Поэтому необходимо следить за тем, чтобы не вращаться слишком быстро. Обычно мы вращаемся со скоростью около 0,1 герц. Затем трос ДНК перегружается медленно вращающимися магнитами, заданным числом оборотов, и, записывая еще один след угловых колебаний, количество и скорость оборотов магнита снова вводятся в соответствующую панель управляющего программного обеспечения для лабораторного просмотра.

Здесь количество оборотов установлено равным 40, а скорость установлена на 0,1 герца. Это приведет к тому, что магниты будут медленно вращаться во время измерения для определения крутящего момента, накопленного в тросе нуклеиновых кислот. После N оборотов мы используем приведенную здесь формулу, где угловые скобки обозначают среднее и тета-ноль.

А тета N — угол при нуле оборотов, соответствующий крутильно расслабленному тросу и поворотам соответственно. Повторите шаги вращения магнитов и зарегистрируйте плато угловых флуктуаций, если это необходимо, чтобы полностью определить реакцию молекулы на ток за один сеанс измерения. Измерить изменения в скручивании ДНК, вызванные белком репарации RAD 51, связывание которого с двухцепочечной ДНК удлиняет и раскручивает.

ДНК rad 51 добавляли к молекуле ДНК, привязанной в шрифте. Как показано на рисунке, бусина прослеживает спиралевидную траекторию. Это движение может быть разделено на компоненты, которые описывают, как ДНК удлиняется и раскручивается с течением времени.

Для измерения крутящего момента, хранящегося в ДНК с помощью МТТ, молекула с систематическим нанесением и под намоткой и угловыми колебаниями измерялась для каждого числа приложенных витков. Стандартное отклонение угловых колебаний, которое сообщает о жесткости угловой ловушки, должно быть независимым от количества приложенных оборотов. Здесь стандартное отклонение составляет около девяти градусов, как показано здесь.

Среднее значение угловых положений систематически изменяется с числом приложенных оборотов с использованием постоянной жесткости угловой ловушки. Изменения среднего угла преобразуются в крутящий момент, в результате чего крутящий момент, хранящийся в ДНК, сравнивается с приложенными поворотами. Одновременная запись положения бусин по оси Z дает длину ДНК по сравнению с нанесенными витками.

Вместе эти две кривые дают полную механическую реакцию ДНК на перемотку и подмотку. После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее представление о том, как измерять, скручивать и крутить биологические молекулы с помощью магнитного пинцета со свободной орбитой и магнитного моментного пинцета для новых анализов одиночных молекул, к которым можно легко адаптировать обычные магнитные пинцеты. Развитие этих методов открывает путь для исследований в области биофизики, например, для изучения крутильных свойств ДНК или РНК и наблюдения за такими процессами, как уплотнение и репарация ДНК.