Phosphopeptide Анализ грызунов придатка яичка сперматозоидов

Общая цель данного эксперимента заключается в количественном определении изменений фосфопептидов, происходящих в сперматозоидах во время созревания сперматозоидов. Это достигается путем удаления придатка яичка у мыши, выполнения ретроградной обратной промывки сперматозоидов и сбора клеток в микрокапиллярную трубку. Затем сперматозоидам дают выплыть в сбалансированный раствор соли, который позволяет удалить загрязняющие белки, а затем они промываются и осаждаются, чтобы удалить загрязняющие соли и жиры.

Белки желчи расщепляются с использованием трипсина, а затем обогащаются диоксидом титана с целью обогащения фосфопептидами. Полученные результаты показывают количественные изменения статуса фосфорилирования белков на основе жидкостной хроматографии, масс-спектрометрического анализа. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области репродуктивной биологии, например, каковы фосфопротеомные изменения при прохождении сперматозоидов через ЭПИ или во время емкости.

Хотя этот метод дал представление о биологии сперматозоидов, он также может быть применен к модельным организмам, исследованиям заболеваний, таких как рак, неврологические патологии и общие пути передачи сигналов. Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, поскольку трудно определить анатомию областей, в которых будут манипулироваться EPI. Начните с приготовления 200 миллилитров раствора Биггерса, Уиттена и Уиттена или рабочего стебля BWW, добавив следующее в один литр воды Milli Q, чтобы сделать канюлю.

Использование полиэтиленовых трубок с внутренним и внешним диаметрами 0,4 миллиметра и 1,1 миллиметра соответственно. Держите его на медленном огне, пока трубка не начнет плавиться. Немедленно потяните концы трубки наружу, чтобы растянуть ее, тем самым уменьшив внешний диаметр.

Разрежьте трубку так, чтобы произвести сужение одного конца, что позволит легче канюляцию S deens. Отрежьте противоположный конец примерно на 15 сантиметров. Затем вставьте иглу 30 калибра в тупой конец, и прикрепите к ней полностью втянутый трехмиллилитровый шприц.

Сделайте присоску, отрезав 20-сантиметровую длину полиэтиленовой трубки и вставив ее в один конец канюли. Вставьте держатель микрокапиллярной стеклянной трубки и стеклянный микрокапилляр. После усыпления мыши согласно текстовому протоколу сделайте небольшой разрез в мошонке, чтобы обнажить эпи.

Тогда используйте пару часовщиков. Щипцы номер пять для вытягивания яичка и придатка яичка из полости. Обрежьте, чтобы удалить все, кроме одного-двух сантиметров обширного выступа от придатка ката.

Затем разрежьте для удаления проксимальных протоков EENT и ткани, соединяющей придаток яичка яичка с яичком, и удалите весь мужской репродуктивный путь под препарирующим микроскопом с использованием увеличения от 5 до 40 раз. Поместите один-два сантиметра зауженного конца канюли в поле зрения и с помощью ленты закрепите его с помощью пятого часового щипца. Аккуратно обхватите каждую сторону обширным выступом и натяните его на видимую часть канюли.

Затем с помощью невпитывающегося черного плетеного обработанного шелка завяжите надежный узел вокруг канюлированной ткани с помощью часовщиков. Щипцы номер пять. Возьмитесь за дистальный конец kata epi ides и снимите тунику Eugenia.

Чтобы обнажить один эпидермальный каналец, аккуратно обнажите каналец и раздразните его, чтобы создать отверстие для выхода сперматозоидов. Затем осторожно нажмите на поршень шприца, чтобы выпустить воздух в обширную зону. Давление приведет к тому, что сперматозоиды выйдут из разорванной канальцы.

Затем приложите отсасывание к мундштуку, чтобы втянуть сперматозоиды в стеклянный капилляр. Осторожно подуйте в мундштук или прикрепите шприц и изгоните сперматозоиды из стеклянного капилляра в один миллилитр довоенного раствора B WW. И используйте раствор, чтобы промыть клетки три раза, чтобы удалить любые загрязняющие белки.

После удаления последней промывки заморозьте сперму для последующего использования или используйте 4% чапс, два моляра тио мочевины и 50 миллимоляров трис pH 7,4 для солюбилизации белков инкубируйте в течение одного часа с прерывистым вортексом. Затем центрифугируют раствор при 10 000 GS в течение 20 минут и переносят надосадочную жидкость в новую пробирку для уменьшения дисульфидных связей и алкилирования белков в DTT в конечной концентрации 10 миллимоляров к белковому раствору. Вортексируйте и выдержите при комнатной температуре в течение 30 минут.

Затем добавьте 50 миллимоляров ИО-ацетамида в лизатный вихрь и выдержите 30 минут при комнатной температуре в темноте. Чтобы осаждать белки, соедините один объем лизата, один объем метанола и 0,5 объема хлороформа. После вортексирования образца вращайте его с температурой 10 000 G в течение двух минут, соберите верхний слой, оставив около двух миллиметров, чтобы избежать аспирации интерфейса.

Добавив один объем метанола, аккуратно переверните трубку и снова вращайте. Выбросьте надосадочную жидкость и высушите гранулу на воздухе в течение трех-четырех минут, чтобы провести трипсин, пищеварение и обогащение фосфопептидами. Начните с использования 25 миллимолярного бикарбоната аммония, содержащего один моляр мочевины.

Чтобы восстановить трипсин, смешайте F 50 к одному весовому соотношению белка к трипсину и инкубируйте в термомиксере при температуре 37 градусов Цельсия и 700 об/мин в течение ночи. После отжима для гранулирования непереваренного материала перенесите надосадочную жидкость в новую пробирку. Используя буфер DHB, приготовленный в соответствии с текстовым протоколом, разбавьте инизированные пептиды в десять раз и нанесите его на 200 мкг сухих гранул диоксида титана, инкубируйте на ротаторе в течение одного часа при комнатной температуре после инкубации, используйте буфер DHB для еще одной промывки образца перед использованием промывочного буфера, состоящего из 80% А CN и 2% TFA, для трехкратной промывки образца после окончательного центрифугирования элюируйте фосфопептиды путем добавление 2,5% гидроксида аммония сразу после отжима и сбора надосадочной жидкости.

Используйте 0,3 микролитра муравьиной кислоты для подкисления образца, как показано на рисунке. Одним из преимуществ этого протокола является то, что сперматозоиды изолированы. В состоянии покоя многие клетки слипаются сразу после выталкивания в среду B WW.

Однако через 10 минут они становятся модальными и раствор становится однородным. Препарат, описанный в этом видео, обычно дает 200 умножить на 10 до шести зоа. Этот рисунок демонстрирует чистоту сперматозоидов из AR крысы Cota epididymus.

Одним из основных вопросов, связанных с пробоподготовкой, является выход из поездок и сбраживание. В отличие от осаждения ТСА, которое часто требует корректировки pH образца, осаждение фенолхлороформа происходит быстро и не подкисляет показанный здесь образец представляет собой белковую гранулу, обычно видимую из 100 микрограммов образца между нижней и верхней границей раздела. Вот воспроизводимость этого протокола.

Синие полосы, появляющиеся с течением времени, являются пептидами, исходящими из наноколонки C 18. По мере увеличения концентрации ацетонитрила в модальной популяции на уровне около 651,5 Дальтон образуется пептидный кластер, который полностью отсутствует в небольшом диапазоне. Однажды протокол обогащения фосфатным пептидом является эффективным методом.

При выполнении этой процедуры важно помнить, что подготовка образцов является ключевым аспектом для получения воспроизводимых результатов протеомики. Этот метод может быть адаптирован для выделения гликопротеинов, которые могут быть использованы для ответа на дополнительные вопросы, например, какие белки претерпевают изменение в содержании кремовой кислоты в их протеоме.