В ово Электропорация куриных эмбрионов

Электропорация — это метод, используемый для введения чужеродного генетического материала в клетки. Электропорация куриных эмбрионов внутри яйца или в яйцеклетке является ценным инструментом для биологов, изучающих развитие, поскольку доставка генетического материала может быть локализована в определенных тканях и определенных временных точках развития. В этом видео мы познакомим вас с основными принципами электропорации in ovo, опишем основные этапы процедуры и обсудим, как этот метод может быть использован для изучения биологических процессов во время развития.

Для начала давайте рассмотрим основные принципы электропорации, чтобы выяснить, как с ее помощью можно доставить ДНК в клетку.

Во-первых, микроинъекция используется для доставки ДНК в непосредственной близости от интересующей клетки. Однако ДНК не может проникнуть через плазматическую мембрану, чтобы попасть в клетку.

Для решения этой проблемы применяется электрический ток, который нарушает стабильность мембраны, создавая поры. Вторым следствием этого электрического поля является миграция отрицательно заряженной ДНК к положительному электроду. В результате только клетки на стороне места инъекции, расположенные ближе к положительному электроду, трансфицируются ДНК.

Теперь, когда вы знаете основные принципы, поговорим о том, как подготовить эмбрионы к электропорации. Если вам необходимо использовать эмбрионы старше 20-й стадии по Hamburger Hamilton, лучше всего культивировать цыплят вне скорлупы или ex ovo для улучшения доступа к тканям. В этом видео речь пойдет об электропорации, проводимой на ранних стадиях развития эмбрионов в раковине или в яйце.

Для начала яйца следует инкубировать во влажном инкубаторе при температуре 37 °C до тех пор, пока они не достигнут желаемой стадии развития. Пока яйца инкубируются, подготовьте инструменты для инъекции и электропорации. Сначала сделайте капиллярные иглы, вытянув стеклянную пипетку диаметром 0,5 мм с помощью съемника пипетки. Чтобы открыть пипетку, поместите ее под микроскоп и отломите небольшой кусочек кончика. Затем приготовьте раствор для инъекций, который должен содержать соответствующее разведение вашей конструкции, а также краситель, который поможет вам визуализировать вводимый раствор.

Чтобы контролировать движение жидкости внутри иглы, прикрепите ее к ротовой пипетке, приводимой в действие человеком. В качестве альтернативы игла может быть загружена на микроинжектор, который обеспечивает регулируемое давление импульсов воздуха. Заполните иглу, погрузив наконечник в раствор для инъекций и приложив отрицательное давление.

В дополнение к иглам вам также понадобятся электроды. Они состоят из двух оголенных проводов, закрепленных вместе с помощью адаптера. Пара кабелей соединяет электроды с электрическим генератором импульсов, или электропоратором, который контролирует длительность, частоту и напряжение импульса. Для работы без помощи рук электропоратор может быть активирован ножной педалью.

Как только яйца будут готовы, вырежьте в скорлупе окошко и добавьте несколько капель физиологического раствора соли, например, Ганкса, чтобы предотвратить высыхание эмбриона. Под микроскопом расположите яйцеклетку таким образом, чтобы интересующая ткань была доступна для иглы. Затем проткните эмбрион капиллярной иглой и подайте раствор, слегка надавливая.

Теперь, когда мы ввели конструкцию, пришло время провести электропорацию. Расположите электроды так, чтобы они были погружены в раствор Хэнка, а интересующая ткань была центрирована между ними. Чтобы подать электрический ток, нажмите на ножную педаль и ищите пузырьки, образующиеся вокруг электродов.

После завершения электропорации извлеките электроды из эмбриона и протрите их 70% этанолом. Добавьте несколько капель солевого раствора, дополненного антибиотиками, чтобы предотвратить инфицирование, и заклейте окно скотчем. Наконец, поместите яйца обратно в инкубатор для продолжения развития перед фенотипическим анализом.

Теперь, когда мы узнали все об ово-электропорации, давайте рассмотрим несколько примеров того, как ученые применяют эту технику в исследованиях развития.

Начнем с того, что электропорация может быть использована для блокирования экспрессии генов путем доставки нокдаун-конструкций. В этом примере клетки развивающейся нервной трубки были подвергнуты электропорации с помощью конструкций для сайленсинга генов. Эмбрионам дали развиваться, а затем сравнивали траектории аксонов между нормальными и нокдауновыми образцами для оценки генетического контроля наведения аксонов.

С другой стороны, электропорация in ovo также может быть использована для экспрессии белка в подмножестве клеток путем введения плазмиды, содержащей ген, кодирующий белок, и промотор: последовательность, которая связывает РНК-полимеразу для инициирования транскрипции. Здесь ученые доставили один ген в клетки эмбрионального мозга. Окрашивание тканей для обнаружения как белкового продукта этого гена, так и маркеров конкретных нейронных подтипов показывает, что электропорированный ген изменяет развитие нейронов.

Конструкции ДНК, кодирующие флуоресцентные белки, также могут быть введены с помощью электропорации для визуализации клеток и структур во время развития. Это позволяет визуализировать в реальном времени сложные процессы, такие как развитие спинного мозга, что дает представление о динамике движения клеток с течением времени.

Вы только что посмотрели представление JoVE об электропорации in ovo, полезном методе доставки генетического материала цыплятам. В этом видео обсуждаются основные принципы электропорации, шаги, необходимые для инъекции и электропорации цыплят, а также применение этого метода в текущих исследованиях в области развития. Спасибо за просмотр!