Измерение уровней Гем синтез в клетках млекопитающих

Общая цель этой процедуры заключается в измерении уровней синтеза гема в клетках млекопитающих с помощью специфического радиоактивного предшественника синтеза гема. Это достигается путем первичной инкубации клеток с 5 иммунолилиновой кислотой, меченной C14, которая будет включена в гем. Второй шаг заключается в сборе клеток путем соскабливания и последующем их влиянии с помощью буфера для экстракции гема.

Далее добавляется датиловый эфир для извлечения гема и собирается эфирная фаза. Заключительным этапом является промывка эфирной фазы соляной кислотой для отделения порфиринов от гема. В конечном счете, уровни синтеза гема могут быть измерены в клеточных линиях, и результаты показывают дифференциальные уровни синтеза гема и различных раковых клеток и HK 2 93 T.

Основное преимущество этого метода по сравнению с существующими методами, такими как использование глицина C 14 или железа 59, заключается в том, что C 14 ELA очень специфичен и измеряет поток всего пути. Кроме того, излучение C 14 очень слабое по сравнению с железом 59. Применение этого метода распространяется на диагностику и терапию рака и неврологических заболеваний, потому что измененный метаболизм связан с различными заболеваниями, включая рак и неврологические заболевания.

Заполняемость клеток для анализа гема зависит от типа клеток и скорости их роста семенных клеток в 3,5-сантиметровых пластинах, так что в день измерения гема беглость составляет от 80 до 90%. Рекомендуется использовать отдельные пластины, потому что с ними легче работать за день до измерения. Добавьте в клетки меченые радиоактивными веществами пять иммунолейновых кислот С14 А ЛК.

Поскольку требуемое количество радиосигнала, помеченного как LA, может варьироваться в зависимости от клеточной линии, минимальное количество, необходимое для исследуемых клеточных линий, должно быть определено заранее. Для большинства экспериментов достаточно от 0,1 до 0,3 микрокарри, чтобы получить хорошее измерение для каждой культуры. В блюдо добавьте от 0,1 до 0,3 микрокарри, пять A LA и холодный A LA до конечной концентрации 20, микромоляр от общего количества L.A. Добавление холодного A LA не является обязательным.

Принимайте соответствующие меры предосторожности во избежание загрязнения экспериментатора и окружающей среды, а также следуйте местным рекомендациям по радиационной безопасности для утилизации всех отходов. Инкубируйте клетки с радиоактивным A LA в течение 16 часов. Чтобы начать эту процедуру, поместите чашки для клеточных культур, содержащие радиоактивно помеченные клетки, на лед и отнесите их в зону, предназначенную для работы с радиоактивностью.

Весь процесс экстракции и выпаривания должен выполняться во взрывозащищенном колпаке. С помощью пипетки отсадите от среды, промойте клетки один раз одним миллилитром одного х холодного. PBS отсасывайте PBS и добавьте один миллилитр холодного PBS.

С помощью резинового полицейского соскребите и соберите ячейки. Переложите ячейки в предварительно охлажденную двухмиллилитровую микроцентрифужную пробирку. Собрав элементы со всех пластин, вращайте все трубки при температуре 15 000 G в течение одной минуты при четырех градусах Цельсия.

Отдохните от PBS и вращайтесь. Вкратце, удалите остатки PBS и повторно суспендируйте клетки в 100 микролитрах PBS в вихре и удерживайте их на льду. Перелейте 10 микролитров клеточной суспензии из каждой двухмиллилитровой пробирки в микроцентрифугу объемом 1,5 миллилитров.

Сразу добавьте буфер для лизиса клеток и храните на льду. Эта Eloqua будет использоваться позже для измерения концентрации белка. Вращайте оставшиеся 90 микролитров клеточной суспензии в двухмиллилитровой пробирке при температуре 5000 G в течение 30 секунд при четырех градусах Цельсия.

Полностью извлеките PBS с помощью наконечника для пипетки объемом 200 микролитров. Добавьте 300 микролитров буфера для экстракции гема или HEB в каждую пробирку и сформируйте вихрь для ресуспензии. Гранулы работают только с одной-двумя трубками за раз, потому что гранула должна быть быстро ресуспендирована, не оставляя ее в HEB слишком долго.

После того как HEB добавлен во все пробирки и гранулы повторно суспендированы, вихрь на 15 секунд перемешать и положить на лед на одну минуту вортекс и лед таким образом три раза. Далее добавьте в каждую трубку по 1,2 миллилитра эфира датила. Поскольку датиловый эфир выходит из наконечников пипеток, он быстро пипетируется вверх и вниз один или два раза, что помогает удерживать его в вихре наконечника пипетки в течение 30 секунд.

Вращайте при температуре 15 000 G в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия. С помощью пипетки объемом в один миллилитр перенесите верхнюю эфирную фазу из каждой пробирки в новую микроцентрифужную пробирку. Добавьте в каждую трубку по 0,5 миллилитра двух обычных соляных кислот

В соляную кислоту было добавлено небольшое количество трианового синего для придания ей бледно-голубого цвета, который поможет позже различить две фазы. Перемешайте пробирки и вращайте при температуре 15 000 G в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия после центрифугирования. Нижняя фаза будет синей, а верхняя фаза будет бесцветной.

Перенесите верхнюю фазу бесцветного эфира в новую пробирку. Каждый раз повторяйте промывку эфирной фазы соляной кислотой еще два раза. Собираем бесцветную верхнюю фазу в новую пробирку и отбрасываем нижнюю синюю фазу.

Переложите верхнюю фазу в сцинтилляционный флакон. Высушите образцы, подержав их в химическом колпаке на ночь. Выпарить датиловый эфир можно на следующий день.

Добавьте по пять миллилитров сцинтилляционной жидкости к каждому из высушенных образцов и хорошо встряхните для перемешивания. Измерьте радиоактивность с помощью сцинтилляционного счетчика. Уровень синтеза гема рассчитывается как количество радиоактивности в пикомоларе на миллиграмм общего белка.

Протокол, продемонстрированный в этом видео, был использован для сравнения уровней синтеза гема между нормальными и раковыми клетками легких, а также отсутствия и наличия митохондриального разъединения. CCCP. При отсутствии CCCP в раковых клетках был обнаружен более высокий уровень синтеза гема. Как и ожидалось, уровни синтеза гемо снижались в присутствии CCCP как в нормальных, так и в раковых клетках.

Уровни синтеза гема также были рассчитаны в хелоклетках в присутствии и отсутствии сенилацетона, или sa SA является мощным и специфическим ингибитором второго фермента в пути биосинтеза гема и, как было ранее показано, ингибирует синтез гема. Результаты показывают, что уровень синтеза гема снижался более чем в десять раз в присутствии sa. Чтобы еще больше продемонстрировать использование этого анализа, уровни синтеза гема были измерены и сравнены в четырех линиях рака и HEK 2 9 3 Т-клеточных линий для статистического анализа.

Уровни синтеза гема в раковых клетках и HT K 2 9 3 Т-клетках сравнивали с уровнями синтеза гема в клетках HCC 4 0 1 7. Звездочками обозначено значение P менее 0,005 после его развития. Этот метод проложил путь исследователям в области рака к изучению метаболизма измененного гема для возможной диагностики и лечения рака.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как измерять уровни синтеза гена в клетках млекопитающих с помощью специфического радиоактивного предшественника синтеза гене, ЛК.