Экс естественных Культура Drosophila куколки яичка и одного мужчины зародышевой линии кисты: Вскрытие, Imaging, и фармакологическому лечению

Общая цель этой процедуры заключается в подготовке ex vivo культур дрозофилы, зрачковых яичек и кист зародышевой линии для проведения визуализирующих исследований в реальном времени и лечения ингибиторами для анализа постмиотического Для миогенеза это достигается путем первого рассечения интактных яичек из раннего пуи через 24 часа после формирования пуриума. Вторым шагом является препарирование одиночных кист зародышевой линии из этих яичек, затем неповрежденные яички и одиночные кисты зародышевой линии могут быть использованы для экспериментов с визуализацией в реальном времени. В качестве альтернативы, следующим шагом является инкубация интактных яичек или кисты зародышевой линии с ингибиторными соединениями.

В конечном счете, иммуноокрашивание тыквы, яичек и флуоресцентная микроскопия используются для мониторинга эффекта лечения. Основное преимущество этого метода культивирования ex vivo по сравнению с существующими генетическими методами заключается в том, что он обеспечивает доступ к дило-сперматогенезу на постмиотических стадиях. В целом, люди, плохо знакомые с этим методом, испытывают трудности, потому что некоторые опыты требуют препарирования и обработки тканей зрачков.

Для начала эксперимента распределите капли 80 микролитров щитков и среду Сан М трех насекомых с фетальной бычьей сывороткой и антибиотиками в 10-сантиметровую чашку Петри. Далее с помощью широкой пары щипцов подберите куколку и перенесите ее каплю среднего размера на блюдо. Затем перенесите материалы в стереомикроскоп, оснащенный оптоволоконным осветителем.

Следите за тем, чтобы яички не нагревались выше комнатной температуры во время рассечения с помощью щипцов номер пять. Возьмитесь за куколку за самый задний конец и удерживайте ее в нужном положении. Захватите передние сферические элементы другой парой щипцов и откройте зрачок на завивку на его переднем конце.

Отклеивайте зрачок до тех пор, пока не обнажится хотя бы часть грудной клетки. Продолжайте удерживать куколку в нужном положении за ее самый задний конец и ослабьте внутреннее давление куколки, вставив обе руки пары щипцов в область головы куколки. Затем разорвите куколку, открыв щипцы и переместив щипцы в переднем направлении, и убедитесь, что отверстие как можно больше с первой попытки.

Не повреждайте куколку на заднем конце до того, как давление будет сброшено. Так как это может привести к тому, что яички будут проталкиваться прямо через маленькое отверстие и повреждаться. Как только куколка вскрывается, высвобожденное внутреннее давление куколки выдавливает гломерат жировых клеток тела и тканей через большое отверстие.

Затем увеличьте размер отверстия с помощью одной пары щипцов и избегайте сдавливания куколки щипцами, так как это может повредить яички. Затем прижмите куколку к ее самому заднему концу. Другую пару щипцов аккуратно выведите содержимое куколки от заднего к переднему, чтобы освободить яички от куколки.

Проверьте, не были ли вытолкнуты яички зрачка. Они не будут соединены ни с какой другой тканью. Через 24 часа ПФ соберут семенники с предварительно отрезанным наконечником для пипетки объемом 200 мкл.

Передавайте только небольшое количество среды, чтобы уменьшить количество жировых клеток организма, переносимых с яичками. Затем поместите семенники в среду в посуду для свежей культуры. Промойте яички несколько раз медиумом, пока не останется несколько жировых клеток тела для визуализации в реальном времени.

Перенесите семенники в чашку для культуры со стеклянным дном со средой и начните вскрытие с помощью инвертированного микроскопа. Перенесите одно или несколько яичек зрачка в чашку для культуры со стеклянным дном, наполненную средой. Используйте стереомикроскоп с оптоволоконной подсветкой и две иглы из нержавеющей стали для вскрытия мужских кист зародышевой линии.

Осторожно прижав одну иглу, приложите одно яичко к его переднему или заднему концу и удерживайте его в нужном положении. Введите другую иглу в яичко и нарушьте оболочку яичка, перемещая иглу в сторону, что освободит многие кисты. Продолжайте удерживать яичко в нужном положении одной иглой.

Затем с помощью другой иглы аккуратно вытащите оставшиеся кисты из яичка. Далее отделяют агрегированные кисты. С помощью наконечника пипетки объемом 200 микролитров перенесите цисты в свежую кисломолочную посуду со средой.

Затем переместите культивируемую чашку в инвертированный микроскоп для визуализации отдельных цист в реальном времени. При необходимости снова разогните кисты иглой, определите стадию кист с помощью фазового контраста и флуоресцентной микроскопии. Сосредоточьтесь на кисте нужной стадии.

Часто подтверждайте очаг и положение кисты. Во время более длительных экспериментов с визуализацией цисты не прилипают к дну чашки для культивирования. Намерение выпасть из фокуса.

Заполните каждую лунку 24-луночного планшета для культивирования клеток 500 микролитрами среды для одного эксперимента из 12 повторов. Затем перенесите по одному зрачку семенника в каждую лунку с помощью предварительно отрезанного наконечника пипетки объемом 200 микролитров. Далее проверяют на наличие протамина в выделенных яичках с помощью инвертированного флуоресцентного микроскопа.

Яички должны быть свободны от протамина, сигнала B-E-G-F-P, что указывает на то, что переключение гизона на протамин или НР не произошло ни в одной из кист. Замените яички, которые уже показывают положительные кисты. Добавьте 500 микролитров среды, содержащей эндокариновую кислоту, ингибирующее соединение, чтобы достичь конечной концентрации 150 микромоляров в одном миллилитре в каждую из первых 12 лунок.

Остальные лунки используйте в качестве необработанных контролей, добавив 500 микролитров среды с растворителем. Затем инкубируйте пластину при температуре пять градусов Цельсия в течение 24 часов в темноте. Проверьте еще раз на наличие протамина в инкубируемых семенниках.

Контрольные яички теперь должны показать одну или несколько протаминовых, B-E-G-F-P положительных кист, что указывает на переход через переключатель HP. Далее с помощью пипетки с наконечником объемом 200 микролитров переложите яички на предметные стекла, покрытые поли-L лизином. Выполните подготовку патиссонов и окрашивание флуоресцентными антителами.

В соответствии с опубликованными протоколами с помощью этого метода диссекции были получены фазово-контрастные изображения яичек дрозофилы. Это слегка раздавленные целые семенники куколки дрозофилы. Через 24 часа после образования PY или PF сперматогония ограничивается передним концом ниже области хаба.

Остальные яички заполнены сперматоцитами, сперматидами в стадии течения Невина с круглыми ядрами и сперматидами в удлиненных стадиях с растущими жгутиковыми наложениями фазового контраста, получены флуоресцентные изображения EGFP и RFP с домашних монтированных зрачков яичек для обнаружения H, двух A-V-D-R-F-P и протамина B-E-G-F-P при 24 часах A PF. Ни один из сперматид не подвергался частому переключению HP. Рассеченные на этой стадии семенники содержат автофлуоресцентную структуру. Зрачковое яичко, рассеченное через 36 часов A PF показывает первую протамин, B-E-G-F-P положительную кисту.

Зрачки яичек 48 часов A PF имеют несколько кист зародышевой линии с видимыми протаминположительными ядрами. Можно записывать покадровые изображения в реальном времени ex vivo целых семенников, развивающихся в культуре. Используя этот метод, зрачковое яичко рассекали через 45 часов, а ПФ инкубировали в среде в течение шести часов и визуализировали каждые пять минут.

В течение этого периода несколько цист сперматид выходят из стадии переключения HP и демонстрируют яркий протаминовый сигнал B-E-G-F-P. После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как получить раннюю стадическую яичку и одиночную кисту зародышевой линии в культуре для выполнения визуализации in vivo или лечения ингибиторами.