Измерение потоков минеральных питательных веществ и токсикантов в растениях с помощью радиоактивной метки

В растениях измерение потоков питательных веществ и токсикантов имеет важное значение для изучения питания растений и токсичности. В этой статье мы рассмотрим протоколы радиоиндикаторов для определения притока и оттока в корнях неповрежденных растений на примере потоков калия (K⁺) и аммиака/аммония (NH₃/NH₄⁺). Обсуждаются преимущества и ограничения таких методик.

Общая цель данного эксперимента состоит в том, чтобы измерить однонаправленные потоки калия и аммиака в корни и из корней неповрежденных проростков ячменя, а также охарактеризовать функционирование ключевых систем транспортировки питательных веществ в мембранах растений. Это достигается путем предварительного выращивания рассады в течение одной недели в гидропонных растворах определенного химического состава, чтобы убедиться, что растения находятся в питательном стабильном состоянии. Гидропонная культура позволяет сделать корни доступными для экспериментальных манипуляций.

В качестве второго шага корни неповрежденных растений погружаются на различные периоды времени в экспериментальные растворы, в том числе в растворы для поглощения, в которые представляет интерес субстрат, наполненный радиоактивным изотопом. Этот шаг будет использоваться для определения скорости транспортировки в рассаду и из нее. Затем растения либо препарируются сразу после короткого периода поглощения для экспериментов с однонаправленным притоком, либо переносятся в воронку FLX после более длительного поглощения для измерения высвобождения индикаторов.

С помощью компартмент-анализа с помощью tracer, flx или Kate были получены результаты, которые могут выявить ключевые аспекты пропускной способности, энергетики, механизмов и регуляции транспортных систем. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы, связанные с физиологией питания растений, например, как минеральные питательные вещества и токсиканты переносятся внутрь и из растений. Как такие потоки реагируют на изменение окружающей среды и как они влияют на клеточную и тканевую компартментацию субстрата?

И, наконец, как абиотические стрессы, которые ставят под угрозу экологическую среду в сельском хозяйстве, такие как засоление, засуха и токсичность тяжелых металлов, влияют на потоки питательных веществ в растениях и динамику. Основное преимущество этого метода по сравнению с существующими методами, такими как анализ истощения или накопления субстрата или измерение селективных вибрационных электродов железа, заключается в том, что мы можем измерять однонаправленные потоки, в отличие от чистых изгибов, что является разницей между притоком и eFlex. Таким образом, мы можем получить ценную информацию о емкости энергетики, механизмах и регулировании транспортных систем для питательных веществ и интоксикантов растений.

Модельный вид ячменя будет использоваться в этом эксперименте, выращивать рассаду ячменя на гидропонике в течение семи дней в камере для выращивания с контролируемым климатом за день до эксперимента, связать несколько саженцев вместе, чтобы получить одну реплику. Оберните двухсантиметровый кусок трубки из тигона вокруг базальной части желобов и закрепите трубку лентой, чтобы получился воротник. Используйте три растения в пучке для прямого притока или анализа DI и шесть растений в пучке для компартментного анализа с помощью индикатора, flx или анализа Кейт за день до эксперимента.

Подготовьте следующие материалы и растворы для сбора растворов для предварительной маркировки, маркировки и десорбции, пробирок центрифугирования и флаконов с образцами, аэрации и смешивания всех растворов для Кейт. Хорошо соберите следующее. Смешанные аэрированные растворы для этикетирования и элюирования, прокладки для оттока, центрифугирующие пробирки и флаконы с образцами.

Подготовьте радиоиндикаторы в день проведения эксперимента, соблюдая все требования лицензии учреждения на радиоактивные материалы. Носите надлежащее защитное оборудование и дозиметры и используйте соответствующую защиту для приготовления радиоактивного изотопа калия. Калий 42.

Положите чистый сухой стакан на весы и обнулите баланс. Достаньте флакон с индикатором из упаковки и высыпьте порошок в стакан. Обратите внимание на массовую пипетку, 19,93 миллилитров дистиллированной воды в стакан, после чего следует 0,07 миллилитров серной кислоты.

В дальнейшем рассчитывается концентрация радиоактивного исходного раствора. Учитывая массу и молекулярную массу карбоната калия, а также объем раствора, используйте счетчик Гейгера Мюллера для регулярного мониторинга загрязнения. Радиоактивный изотоп азота-13 производится в циклотроне и поступает в виде жидкости для измерений DI.

С помощью пипетки калия 42 количество радиоактивного исходного раствора необходимо для достижения желаемой конечной концентрации калия в растворе для мечения Для измерения DI с помощью пипетки азота 13 внесите небольшое количество менее 0,5 миллилитров радиоиндикатора в раствор для мечения. Дайте этикетировочному раствору тщательно перемешаться с помощью аэрации. Затем пипеткой нанесите подобразец раствора для мечения объемом в один миллилитр в каждый из четырех флаконов с образцом.

Измерьте радиоактивность во флаконах с помощью гамма-счетчика. Убедитесь, что счетчик запрограммирован таким образом, что количество отсчетов в минуту или показания CPM корректируются. Для изотопного распада, который особенно важен для короткоживущих индикаторов, рассчитайте удельную активность раствора для мечения S, не выраженную в виде подсчетов в минуту на микромоль путем усреднения количества четырех образцов и деления на концентрацию субстрата в растворе, погрузите корни ячменя в нерадиоактивный раствор для предварительного мечения на пять минут для предварительного уравновешивания растений в условиях испытаний.

После этого погрузите корни в раствор радиоактивного мечения на пять минут. Перенесите корни в раствор ДЕСОРБЦИИ на пять секунд, чтобы удалить основную часть поверхностной прилипшей радиоактивности. Затем переложите корни во второй стакан с раствором десорбции на пять минут.

Чтобы дополнительно очистить корни от внеклеточного индикатора, рассеките и отделите побеги, прикорневую поросль и корни. Поместите корни в центрифужные пробирки и вращайте образцы в течение 30 секунд в низкоскоростной клинической центрифуге. Чтобы удалить поверхностные и междоузельные воды, утяжелите корни для получения свежего веса.

Измерьте радиоактивность в образцах растений с помощью гамма-счетчика, рассчитайте приток в растение по этой формуле. Начните эту процедуру с приготовления этикетировочного раствора и измерения S-образного узла, как показано ранее. После измерения s добавьте 19 миллилитров воды в каждый образец таким образом, чтобы итоговый объем был равен объему EIT в 20 миллилитров.

Подсчитайте радиоактивность в каждом образце объемом 20 миллилитров. Погрузите корни в раствор для этикетирования на один час. Через час извлеките растения из раствора для маркировки и перенесите их в воронку FLX, убедившись, что весь корневой материал находится внутри воронки.

Аккуратно закрепите растения сбоку от воронки оттока, наклеив небольшую полоску скотча поверх пластикового воротника. Запустите таймер для отсчета в секундах, а через 15 секунд откройте кран и соберите ЭИТ в пробирку с образцом. Закройте кран аккуратно влейте следующий ВИТ в воронку.

Таким образом, соберите EIT за оставшуюся часть серии Elucian за общий период EU в 29,5 минут. После того, как протокол ЕС будет завершен, соберите урожай растений, как показано ранее, подсчитайте радиоактивность в ЭИТ и образцах растений с помощью гамма-счетчика, умножив показания для каждого СПЭ на коэффициент разбавления, график высвобождения индикатора в зависимости от времени элюирования для стационарных условий, выполните линейную регрессию и расчет потоков. Половина лжи биржи и размеров пула.

Здесь показаны репрезентативные изотермы для притока аммиака в зависимости от различных внешних концентраций аммиака. В неповрежденных корнях проростков ячменя, выращенных при высоком содержании аммиака или аммония, а также при низком или высоком содержании калия аммиак был значительно выше при низком калийном креме McKayla. Менинный анализ изотерм показывает, что высокое содержание калия оказывает относительно небольшое влияние на сродство к субстрату транспортеров поглощения аммиака, но значительно снижает его транспортную способность.

Следующий результат подчеркивает быструю пластичность системы поглощения калия. В корнях неповрежденной рассады ячменя выращивают при умеренном калии и высоком уровне аммония. Почти 350%-ное увеличение притока калия наблюдалось в течение пяти минут после вывода аммония из наружного раствора.

Этот эффект абстиненции аммония был чувствителен к блокаторам калиевых каналов, тетраэтиламмонию, барию, цезию. Эти графики показывают равновесное состояние калия 42 EFL в корнях неповрежденных проростков ячменя, выращенных при низком содержании калия и умеренном содержании нитратов, а также непосредственное воздействие 10 миллимолярного хлорида цезия, пяти миллимолярных сульфатов калия и пяти миллимолярных сульфатов аммония на FLX калия FLX ингибировалось либо цезием, либо калием, но стимулировалось аммонием. Кате также может быть использован для оценки концентраций и времени оборота субстрата в субклеточных компартментах.

Регрессионный анализ медленно обменивающейся фазы высвобождения индикатора наряду с удержанием индикатора в тканях растений может получить важную информацию о размере пула и периодах полураспада обмена субклеточных компонентов, таких как клеточная стенка, цитоплазма и va. В этой таблице приведены параметры кейпа, полученные из измерений равновесного калия 42 flx в проростках ячменя, выращенных либо с использованием одного миллимолярного нитрата, либо 10 миллимолярного аммония. Последний представляет собой токсичный сценарий.

Высокое содержание аммония вызывает подавление всех потоков калия и значительное уменьшение размера бассейна. После освоения эффективность методологии DI может быть повышена за счет поэтапного проведения процедур с интервалом в 30 секунд. Таким образом, мы можем исследовать до 10 условий в одном эксперименте.

Точно так же несколько прогонов Кейт могут быть проведены одновременно при наличии достаточного времени между прогонами. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как измерять потоки питательных веществ и интоксикантов в неповрежденных растениях с помощью радиоактивных индикаторов.