Неферментативное, сыворотка-бесплатно культуры ткани из Pre-инвазивных поражений груди для самозарождения Mammospheres

Первичной культуры клеток с использованием интактных органоиды ткани обеспечивает систему модели, который имитирует многоклеточных микросреду в естественных условиях. Мы разработали модель первичной культуры груди эпителий тканей бессывороточной что увековечивает смешанные культуры клеток клоны и экспонаты дифференцированные морфологию, без нарушения ферментативной ткани. Грудь органоиды остаются жизнеспособными в течение> 6 месяцев.

Общая цель данного эксперимента состоит в том, чтобы культивировать неферментативно разрушенную стерильную ткань молочной железы, содержащую участки инзипротокальной карциномы или поражения DCIS, для спонтанного формирования маммосфер in vitro. Это достигается за счет частичного погружения небольших кусочков ткани молочной железы, содержащих протоковые сегменты, в минимальный объем свободной от сыворотки среды для обеспечения градиента кислорода и питательных веществ внутри органоида. Затем органоиды культивируют без каких-либо нарушений до тех пор, пока эпителиальные клетки и фибробласты не выйдут из открытых протоков и не прикрепятся к колбе с культурой ткани.

В конечном счете, эпителиальное происхождение возникающего в результате спонтанного образования mam ophere может быть подтверждено как прямым микроскопическим исследованием, так и иммунофлюоресцентным окрашиванием. Основное преимущество этой методики перед существующими методами, использующими ферментативную диссоциацию ткани молочной железы, заключается в том, что наша культура органоидов DCIS молочной железы поддерживает биологический контекст протокового микроокружения, не нарушая клеточных взаимодействий in vivo. Несмотря на то, что этот метод может дать уникальное представление о биологии протоковой карциномы молочной железы in situ, второй может быть также применен к другим типам преинвазивных неопластических поражений, таких как внутриэпителиальная или простатическая интраэпителиальная неоплазия.

При выполнении этой процедуры важно позаботиться о том, чтобы ткань оставалась стерильной во время транспортировки между операционным блоком и зоной обработки тканей. Кроме того, инструменты и реагенты, используемые для обработки тканей, должны быть стерильными, чтобы предотвратить загрязнение При обрабатывании ткани Перед приобретением тканей образцы сначала продезинфицируйте рабочую зону 70% этанолом и откройте пару стерильных перчаток, положив обертку на рабочую поверхность. Поместите стерильную внутреннюю часть перчаточной оболочки лицевой стороной вверх, а затем наденьте перчатки.

Затем очистите поверхность контейнера для образцов 70% этанолом и снимите с контейнера полиэтиленовую пленку. Поместите образец ткани молочной железы на обертку перчатки, а затем окуните два ватных тампона в краситель для маркировки ткани. Прокатите тампоны по поверхности ткани, чтобы нанести краситель на ткань, промокните окрашенную ткань кусочком марли, пропитанной уксусом, а затем разрежьте ткань молочной железы на вертикальные кусочки толщиной примерно пять миллиметров, не разрезая ткань полностью.

Поддержание стерильности ткани является наиболее важной частью процедуры. Чтобы обеспечить успех, важно иметь тампоны с ватным наконечником, стерильный марлевый уксус и лезвия, чтобы обеспечить легкий доступ, чтобы избежать загрязнения во время обработки тканей. Теперь пальпируйте ткани на наличие участков кальциноза, идентифицируя DCIS по характерному твердому бледному виду, окруженному красноватыми резиновыми границами, которые кажутся зернистыми из-за кальциевых спикул.

Вырежьте любые участки кальциноза, в том числе небольшое количество окружающих тканей молочной железы. Затем поместите ткань в стерильную 50-миллилитровую пробирку, содержащую от 20 до 30 миллилитров питательной среды. Перевернув трубку несколько раз, чтобы перемешать ткань и среду, замените надосадочную жидкость свежей средой.

Затем поместите трубку в изолированный контейнер и транспортируйте ткань в лабораторию для культивирования клеток ткани молочной железы. Высыпьте салфетку и небольшое количество питательной среды в стерильную чашку Петри. Затем с помощью стерильного скальпеля отрежьте фиброзную ткань.

Отбросив волокнистые части, разрежьте ткань молочной железы на кусочки площадью около трех квадратных миллиметров, каждый органоид должен содержать, по крайней мере, один заметный сегмент протока в пределах окружающей стромы. Затем с помощью стерильных щипцов поместите органоиды в стерильную колбу для культуры тканей и добавьте 11 миллилитров свежеприготовленной сыворотки, богатой питательными веществами. Взболтайте колбу, чтобы равномерно распределить органоиды по всей среде, а затем инкубируйте колбу при температуре 37 градусов Цельсия и 5% CO2 в течение 48 часов.

На второй день, после инкубации, осторожно поместите колбу на перевернутый предметный столик микроскопа, чтобы проверить потенциальное бактериальное или грибковое загрязнение, стараясь избегать резких движений или закручивания колбы. Если загрязнения не отмечено, верните колбу в инкубатор еще на сутки. Если обнаружено загрязнение, выбросьте колбу и содержимое в соответствующую емкость на третий день, после инкубации.

Поместите миллилитры среды в стерильную емкость при температуре 37 градусов Цельсия на 20 – 30 минут. Затем, не повреждая органоиды, замените кондиционированную среду на предварительно подогретую свежую среду. Очень осторожно поверните колбу, чтобы распределить среду по поверхности колбы, а затем поместите колбу обратно в инкубатор.

После того, как колонии органоидных клеток будут созданы, заменяйте среду каждые три дня, как показано выше. После 10-14 дней культивирования отбрасывайте любые неадгезивные кусочки ткани, маммосферы и 3D-структуры спонтанно возникают из множественных независимых фрагментов ткани протока человека DCIS у разных пациентов с диагнозом атипичная гиперплазия протоков или протоковая карцинома in situ, при этом для спонтанного формирования маммосферных сфер не требуется ни экстракт базальной мембраны сыворотки, ни гелеобразные матрицы. Сферы mammos также генерируют опухоли ксенотрансплантата молочной железы в модели мыши NOD с той же моделью роста, что и при инвазивном раке.

Эти результаты демонстрируют, что клетки-предшественники с инвазивным потенциалом уже существуют в молочной железе человека, протоке DCIS, но, по-видимому, удерживаются, проверяются протоковой нишей и могут быть убедены в органоидной культуре. Эпителиальное происхождение маммосфер и ксенотрансплантатов, полученных из маммосфер DCIS, может быть подтверждено иммунофлюоресценцией. Например, эти изображения демонстрируют идентификацию сфер mammos в культуре envivo с помощью мышиного моноклонального антитела, реактивного к человеческому epca, а также в центре ксенотрансплантата NOD skid.

Гестопатологическое исследование ткани, используемой для культивирования органоидов, выявило сливающиеся внутрипротоковые поражения с интактными границами базальной мембраны, предполагая, что спонтанные маммосферы, сформированные в этой системе культивирования, были получены только из преинвазивных неопластических областей, и не были продуктом редких областей микроинвазии. При проведении этой процедуры важно не забывать общаться с радиологами, патологоанатомами и научным персоналом о необходимости поддержания стерильности тканей во время исследования тканей или визуализации. После этой процедуры можно использовать другие методы, такие как микрочипы белков с обратной фазой или иммуногистохимию, чтобы ответить на дополнительные вопросы.

Например, мы можем спросить, каков молекулярный профиль различных клеточных популяций, которые спонтанно возникают в этой культуральной системе? Наш метод проложил путь исследователям в области протеомики и геномики к изучению аутофагии, кальциевой сигнализации и репарации ДНК в предраковых тканях живой молочной железы.