Ортотопическая инъекции клеток рака молочной железы в молочной жировой ткани мышей для изучения роста опухоли.

Общая цель этой процедуры заключается в исследовании прогрессирования клеток молочной железы после приживления опухолевых клеток в жировой подушке памяти мыши. Это достигается путем введения клеток рака молочной железы в жировую подушку памяти взрослой мыши, а затем измерения объема опухоли с помощью штангенциркуля на заранее определенных временных уровнях. В конце эксперимента определяли массу и объем опухоли, а также собирали кровь и легкие животного для дальнейшего анализа.

В конечном счете, макро- и микрометастазы могут быть количественно определены с помощью визуального и иммуногистохимического анализа соответственно. Основное преимущество этой методики перед существующими методами, такими как подкожная инъекция опухолевых клеток, заключается в том, что место инъекции жирового пакета молочной железы имитирует исходное место образования опухоли молочной железы, что дает более надежные результаты. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области рака молочной железы, например, какие опухоли, супрессоры, онкогены или компоненты стромального компартмента участвуют в прогрессировании рака.

За день до процедуры побрейте мышей N-O-D-S-C-I-D гамма от четвертого соска до средней линии и взвесьте их, чтобы убедиться, что все животные имеют примерно сопоставимый вес. На следующий день промойте культуру клеток аденокарциномы молочной железы человека один раз с помощью PBS, а затем попробуйте анизировать клетки, когда большая часть клеток отделится. Угасите реакцию с помощью 10 миллилитров сыворотки, содержащей среду DMEM, а затем замедлите клетки в течение семи минут при 1200 оборотах в минуту при комнатной температуре, промойте гранулу, чтобы удалить любые следы сыворотки, а затем снова суспендируйте вторую гранулу в PBS.

После подсчета аликируйте клетки в концентрациях 500 000 на 150 микролитров в стерильные микроцентрифужные пробирки на льду. Затем наполните одну 50-миллилитровую коническую трубку 35 миллилитрами PBS, а другую — 70% этанолом и смочите ватные палочки в каждой. Когда все инструменты будут готовы для каждого животного, нанесите офтальмологическую мазь на глаза животного.

Затем с помощью скотча аккуратно удерживайте обезболивающую мышь на грелке и подтвердите седативный эффект ущипыванием пальца ноги. Используйте ватный тампон, пропитанный этанолом, чтобы очистить выбритый участок, а затем с помощью лезвия скальпеля сделайте небольшой разрез между четвертым соском и средней линией. Вставьте пропитанный PBS ватный тампон в разрез, чтобы сделать карман, а затем с помощью пинцета обнажите жировую прокладку с эффектом памяти, которую можно определить по ее белому цвету.

С помощью другой пары пинцетов сожмите жировую подушку у ее основания и полностью обнажите ткань. Затем пипеткой несколько раз подайте клетки аденокарциномы вверх и вниз, чтобы получить однородный клеточный раствор, и осторожно отсасывайте 150 микролитров клеток в инсулиновый шприц. Следите за тем, чтобы держать шприц горизонтально отверстием иглы вверх.

Введите клетки в жировую подушку молочной железы, подтвердив успешную инъекцию набуханием ткани. Затем осторожно отпустите жировую подушку и с помощью москитных щипцов зашить разрез, поворачивая шов вокруг москитных щипцов по часовой стрелке, против часовой стрелки и по часовой стрелке, чтобы сделать три узла. После операции введите анальгетик и поместите каждое животное в лежачее положение в отдельной клетке, наблюдая за мышами до тех пор, пока они полностью не выздоровеют.

Через восемь недель после имплантации клеток мышей готовят к забору органов. Зафиксируйте животное на поролоновой основе и с помощью штангенциркуля измерьте объем опухоли. Затем сделайте длинный вертикальный разрез по средней линии, а затем сделайте два горизонтальных разреза прямо под передней ногой и над задней ногой.

Прикрепите кожу к пене, чтобы обнажить опухоль, а затем с помощью ножниц отделите опухоль от кожи. Затем аккуратно удалите легкие, поместив левое легкое в раствор Боуэна на три дня, после чего этот поверхностный метастатический фолк станет хорошо виден невооруженным глазом, заморозит часть ткани в жидком азоте для последующего выделения РНК и поместит оставшуюся часть опухоли в одну из конических трубок, заполненных формином. Затем, после умерщвления животного путем пункции сердца, образец крови объемом 450 микролитров помещают в микроцентрифужную пробирку, содержащую 50 микролитров 3,2% цитрата натрия, затем замедляют эритроциты и хранят образцы плазмы при температуре минус 20 градусов Цельсия до тех пор, пока дальнейшее использование экспериментальных ошибок, таких как неточная инокуляция клеток или утечка, может привести к изменению размера опухоли или даже к отсутствию опухоли, что приведет к Формирование структуры, внешне похожей на память.

Жировая подушка вводится с контрольным буфером. Скорость роста опухоли также зависит от характера вводимой клеточной линии, и в целом может наблюдаться через кожу мыши. Кроме того, в области вокруг опухоли могут находиться крупные сосуды, которые возникают в результате ремоделирования сосудов и могут играть решающую роль в удалении продуктов жизнедеятельности и снабжении опухолевой ткани питательными веществами и кислородом.

В отличие от экспериментов in vitro, скорость роста опухолевых клеток может быть непостоянной во времени in vivo из-за гипоксии и недостатка питательных веществ. В окружающих тканях могут образовываться некротические участки, и эти участки будут влиять на скорость роста опухоли. Кроме того, введенные клетки, экспрессирующие определенные гены, представляющие интерес, могут влиять на прогрессирование рака, поскольку гены могут вызывать рост опухоли, который начинается быстро, но замедляется в конце или наоборот.

Забор легких в раствор Боуэна помогает визуализировать поверхностные метастатические очаги, которые проявляются в виде приподнятых бледных образований на поверхности легочной ткани. Образование очагов зависит от клеточной линии. Неагрессивные клетки могут давать только микрометастазы, которые можно легко идентифицировать с помощью окрашивания h и e на легочной ткани, содержащейся в парафине.

После этой процедуры могут быть применены другие методы, такие как Элиза, чтобы ответить на дополнительные вопросы, например, как рост экспериментальной опухоли влияет на уровни цитокинов или проангиогенных молекул в плазме.