Генерация геномных делеций в линии клеток млекопитающих, через CRISPR / Cas9

Общая цель этой процедуры заключается в использовании девятинуклеазной системы Cas CRISPR для создания геномных делеций. Сначала происходит электроочистка, две плазмиды CRISPR и репортерная плазмида A GFP одновременно в клетки. Затем, используя флуоресцентную активированную сортировку клеток, изолируйте верхние 3% клеток, экспрессирующих GFP.

Затем отсортированные клетки с предельным разведением и скрининг на клоны биоаллельной делеции с помощью обычной ПЦР. В конечном счете, CRISPR Cas nine может быть использован для изучения генов и генетических элементов путем получения аллелей делеции с потерей функции: по сравнению с мутациями со сдвигом рамки считывания, производимыми одной направляющей РНК, большие делеции, генерируемые системой нуклеаз CRISPR Cas nine, могут помочь обеспечить потерю функциональных мутаций. Такой подход также позволяет легко и дешево проводить скрининг с помощью обычной ПЦР.

Впервые идея этого метода пришла к нам, когда мы обнаружили, что скрининг небольших инделов, созданных одной направляющей РНК, является технически сложным, трудоемким и дорогостоящим, аллели делеции также особенно информативны для изучения генетических элементов, не покрывающих окружающую среду. Для каждой пары CRISPR гранулы дважды по 10 до шести клеток, выращенных в суспензии. Повторно суспендируйте элементы в 100 микролитрах раствора для электропорации, а затем переведите на электропорацию QAT.

Добавьте пять микрограммов CRISPR Cas nine, сконструируйте SG РНК, пять микрограммов CRISPR Cas nine. Сконструируйте SG a B и 0,5 микрограмма экспрессии GFP несколько раз осторожно вверх и вниз для перемешивания. Старайтесь избегать образования пузырей с помощью системы электропорации.

Электроочистите клетки с напряжением 250 вольт в течение пяти миллисекунд в двухмиллиметровом ветре с помощью стерильной передаточной пипетки, немедленно перенесите раствор на один миллилитр предварительно прогретой питательной среды. Инкубируйте клетки при температуре 30 градусов Цельсия в течение 24-72 часов. Пропустите клетки через стерильный фильтр 50 микрон в факсимильную трубку.

Затем по факсу сортируют верхние 3% GFP-положительных клеток, чтобы обогатить клетки, получившие высокие уровни плазмид. После оптимизации предельных условий разведения для интересующих клеток планшет сортировал клетки в 96-луночный планшет и разбавлял по 30 клеток на планшет с 100 микролитрами клеточных культуральных сред на лунку. Для остальных отсортированных объемных ячеек заморозьте половину ячеек для будущей обшивки.

Нанесите пластину на другую половину для скрининга и валидации праймера. Инкубируйте эти объемные клетки при температуре 37 градусов Цельсия в течение трех-семи дней. Дайте клонам инкубироваться при температуре 37 градусов Цельсия в течение от семи до 14 дней в зависимости от времени удвоения клеточной линии.

Используется для выделения геномной ДНК Resus, суспендирования родительских и объемных клеточных гранул в 50 микролитрах раствора для экстракции ДНК. Запустите образец в термоамплификатор для извлечения геномной ДНК. Затем измерьте концентрацию ДНК.

Теперь соберите 20 микролитров ПЦР-реакции, соединив 10 микролитров двух миксов XPCR. 0,5 микролитра 10 микромольного прямого праймера, 0,5 микролитра 10 микромольного обратного праймера, от 50 до 100 нанограмм геномной ДНК и воды до 20 микролитров. Проведите ПЦР для полосы без делеции и полосы для делеции в отдельных реакциях.

Затем поместите образцы в амплификатор и запустите его в течение 35 циклов с температурой колена А 60 градусов Цельсия, как подробно описано в прилагаемом письменном протоколе. Разрешите образцы на геле 2%aros при напряжении 10 вольт на сантиметр с использованием одного буфера XTAE. Затем исследуйте образцы на наличие или отсутствие полос без делеции и делеции.

Рассмотрите стратегию мультиплексирования пар делеционных и неделеционных ПЦР-праймеров в одной реакции. В качестве альтернативы вы можете запускать реакции ПЦР на делецию и реакцию без делеции отдельно. Для суспензии клетки переносят все клоны в одну 96-луночную пластину, которая уже содержит 50 микролитров среды для культивирования клеток на лунку.

Затем переложите по 50 микролитров из каждой лунки в 96-луночный ПЦР-планшет. В качестве альтернативы, для адгезивных клеток, трипсина, глаз, клонов перед переносом в одиночный 96-луночный планшет. Затем перелейте по 50 микролитров из каждой лунки на 96-луночный ПЦР-планшет, центрифугируйте ПЦР-планшет при 400-кратном G в течение пяти минут и удалите надосадочную жидкость, перебросив ПЦР-планшет над раковиной.

Теперь добавьте 50 микролитров раствора для экстракции ДНК в лунку и повторно суспендируйте клеточные гранулы после экстракции геномной ДНК, запустите ПЦР-реакции для обнаружения полос неделеции и делеции из клонов. Рассасывайте продукты ПЦР на геле 2%aros при напряжении 10 вольт на сантиметр. Использование одного буфера XTAE.

Определите клоны с желаемой делецией и амплифицируйте культуры в более крупной тарелке или колбе. В показанном примере наблюдайте слева направо родительские клетки, три неделеционных клона, три моноаллельных делеционных клона и три би-аллельных делеционных клона. Использование нескольких неперекрывающихся пар SG r NNA может помочь контролировать побочные эффекты.

Каждая пара приведет к образованию уникальной делеции. Точка разрыва, нацеленная на SG-пары в различных местах по отношению к гену, может быть использована для удаления всего тела гена с целью создания инделов со сдвигом рамки считывания, даже если один или оба аллеля не были удалены, или для обеспечения нарушения определенной изоформы. В этом эксперименте.

Что касается делеции всего гена, то PIM одна, две пары SG РНК были сконструированы, клонированы в вектор экспрессии PX 3 3 0 и доставлены в клетки MEL путем электропорации. Вместе с репортером GFP, верхние 3% GFP-положительных клеток были клонированы, чтобы ограничить делецию, и скрининг с помощью ПЦР на наличие клонов моно-аллельной и био-аллельной делеции без делеции для этой делеции PIM one. Клоны биоаллельных делеций были отобраны для дальнейшей пролиферации после пяти дней для экспансии.

Каждый клон был повторно протестирован методом ПЦР геномной ДНК для подтверждения делеции и делеции BIC. Ампликоны подвергали секвенированию по Сэнгеру для определения точной делеции. РНК выделяли из клонов делеции BIC и анализировали с помощью R-T-Q-P-C-R для подтверждения потери экспрессии PIM one.

После освоения эта техника может быть завершена в течение нескольких недель для идентификации клонов с жизненно важной делецией. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как использовать девятинуклеазную систему CRISPR CAS для создания геномных делеций путем порирования плазмид CRISPR, сортировки ярких клеток GFP и скрининга отдельных клонов с помощью обычной ПЦР на наличие клонов делеции BioE.