Раскрытие Незримым Игроки в океане - Руководство поле для химии воды и морской микробиологии

Общая цель данной процедуры заключается в сборе и обработке проб окружающей среды в удаленных полевых районах для оценки ключевых биохимических фоновых параметров и водных экосистем. Это достигается путем предварительного сбора достаточных объемов бескомпромиссной пробоотборной воды из соответствующих мест. Вторым шагом является создание систем фильтрации или концентрирования, которые обеспечивают эффективный рабочий процесс, избегая при этом дополнительных операций с контейнером для отбора проб, поскольку дополнительная обработка всегда приводит к потенциальному загрязнению.

Затем каждый образец фильтруется или концентрируется в зависимости от целевых параметров. Заключительным этапом является обработка или фиксация каждого образца в соответствии с требованиями соответствующего аналита. В конечном счете, микроскопия используется для непосредственного подсчета численности вирусов и микроорганизмов и микробной биомассы, а также для проверки качества вирусных и микробных метагеномных образцов.

Этот метод предоставляет инструменты для оценки ключевых параметров, необходимых для получения минимума и информации, необходимой для характеристики и понимания динамики вирусных и микробных сообществ. Основное преимущество этой методики из существующих методов заключается в том, что она обеспечивает комплексный рабочий процесс, проверенный в полевых условиях, который не зависит от лабораторных условий. Демонстрировать процедуру будет Эмма Черч, студентка в лаборатории ряда.

Сбор образцов не показан в этом видео, но описан в сопроводительном текстовом протоколе процесса. Образцы в указанном здесь порядке, начиная с растворенного органического углерода или РОУ для минимизации вероятности загрязнения, устанавливают одну из двух ранее собранных единиц хатай кин и соответствующую ячейку фильтрационного набора. Подсоедините выпускную трубку, ведущую к соответствующему держателю фильтра.

Подсоедините трубку сжатого воздуха к кин-блоку. Промойте все линии 100 миллилитрами пробной воды. Затем с помощью щипцов, промытых кислотой, поместите 25-миллиметровый фильтр GFF в каждый держатель фильтра.

Промойте каждую бутылку из полиэтилена высокой плотности DOC и крышку три раза примерно 20 миллилитрами отфильтрованной воды для проб. Наполните каждую бутылку DOC примерно 40 миллилитрами воды для отбора проб. Соберите как минимум дубликаты образцов DOC, чтобы иметь резервную копию на случай потенциального загрязнения или потери во время транспортировки.

Заморозьте бутылки для отбора проб в вертикальном положении при температуре минус 20 градусов Цельсия до анализа после сбора проб DOC. Продолжайте фильтрацию до тех пор, пока через фильтр GFF не пройдет в общей сложности 500 миллилитров, включая то, что прошло. Во время сбора образцов DOC открутите встроенный держатель фильтра.

С помощью щипцов снимите фильтр на твердые органические частицы или анализ POM и поместите фильтр внутрь квадрата предварительно пробитой алюминиевой фольги. Сложите верхнюю сторону, перевернутую внутрь себя, и заверните. Заморозьте фильтры при температуре минус 20 градусов Цельсия для хранения до тех пор, пока они не будут подвергнуты элементному и изотопному анализу для обработки неорганических питательных веществ.

Поместите фильтр с трековым травлением 0,2 микрометра в каждый держатель фильтра. Снова прикрепите фильтрующие кассеты, реньте каждую 20 миллилитровую пластиковую сцинтилляционную бутылку три раза с пробоотбором воды. Наполните каждую бутылку до плеча.

Заморозьте при минус 20 градусах Цельсия на потом. Анализ. Чтобы подготовить образцы для микроскопии, снимите фильтродержатель и соберите по одному миллилитру воды в каждую из двух микроцентрифужных пробирок. Добавьте 66 микролитров 32% паральдегида в одну из аликвот для использования в дальнейшем.

Для окрашивания кибер-золотом добавьте 12 микролитров 25% глутаральдегида к другой аликвоте для последующего окрашивания. Аккуратно перемешайте и дайте образцам закрепиться не менее 15 минут. При комнатной температуре в темное время суток образцы для микроскопии должны быть обработаны в течение одного часа.

Чтобы подготовить образцы для проточной цитометрии, поместите в один из фильтродержателей поликарбонатный фильтр с восемью микрометрами, чтобы исключить попадание мусора и крупных клеток. Пропустите воду для отбора проб, чтобы заполнить два криопробирки для каждого места отбора проб. С одним миллилитром образца добавьте пять микролитров 25% глутаральдегида в каждый криофлакон.

Переверните флаконы для перемешивания и дайте образцам зафиксироваться от 15 до 30 минут при комнатной температуре. Затем вспышкуйте, заморозьте образцы в жидком азоте и храните при температуре минус 80 градусов Цельсия до анализа на проточном цитометре. Чтобы начать процедуру подготовки микробных метагеномных образцов, снимите непосредственно встроенные держатели фильтров.

Монтируем острие 22 микрометра цилиндрическое. Отфильтруйте по соответствующей строке. Отфильтруйте оставшуюся пробу воды из обеих единиц кожи шляпы с каждого участка через один фильтр.

После фильтрации вытолкните оставшуюся воду из каждого фильтра с помощью чистого 10-миллилитрового шприца, наполненного воздухом. Поместите фильтр обратно в оригинальную упаковку и заклейте упаковку лабораторной лентой. Храните индивидуально упакованные фильтры при температуре минус 20 градусов Цельсия.

Далее подготавливают метагеномные образцы вируса. Немедленно переложите образцы в вымытые ведра, чтобы убедиться, что проба не потеряна или не загрязнена окружающей средой. Предварительно отфильтруйте с помощью нейлоновой сетки с большими порами, чтобы удалить мусор и клеточный материал перед концентрацией.

Настройте фильтры тангенциального потока или TFF, как показано на этой схеме. Поместите подводящий трубопровод в ведро для образца и оставьте возвратный трубопровод и трубопровод фильтрата в раковине. Включите перистальтический насос и промойте трубопроводы одним-двумя литрами пробной воды.

Поместите возвратный трубопровод в ведро для проб, чтобы завершить цикл, и добавьте 0,7 бар противодавления, концентрируя морскую воду. Доливайте в резервуар для проб по мере снижения уровня. Когда уровень воды упадет ниже линии забора в ведро, переложите концентрат в отбеливатель, промытый тройным полосканием бедного стакана, и продолжайте концентрацию.

Если резервуар пуст, снимите противодавление, увеличьте скорость насоса и протолкните весь образец через трубопроводы, восстанавливая его в стакане трипо. Пропустите концентрат через цилиндрические фильтры с точкой 45 микрометров, чтобы удалить большинство бактерий без дискриминации по вирусным линиям. Соберите в точку 45 микрометров отфильтрованный вирус.

Концентрат в пробирках объемом 50 миллилитров. Поменяйте точку 45 микрометров цилиндрических фильтров. После того, как каждые 150 миллилитров после сбора отфильтрованного вирусного концентрата будет собрано, добавьте 250 микролитров хлороформа в каждую 50 миллилитров аликвоты, чтобы устранить остатки бактерий, инвертировать в смесь.

Храните пробирки в вертикальном положении при температуре четыре градуса Цельсия до последующей обработки. Наконец, высушите фильтры размером 0,45 микрометра и храните их, как показано для микробных метагеномных образцов. Извлечение геномной ДНК из микробных и вирусных образцов не будет показано в этом видео, но процедура описана в сопроводительном протоколе.

Здесь представлен текстовый репрезентативный анализ образцов микроскопии. Предметные стекла, окрашенные в виде красителей и кибер-золота, исследуются для измерения численности и распределения бактерий и вирусов по размерам. Собранные образцы дополнительно оценивают на соотношение аутотрофов гетеротрофных микробов с помощью проточной цитометрии для определения общего количества клеток бактерий, образцы окрашивают зеленым кибергом, используют канал для хлорофилла и FICO eryn для подсчета обилия автотрофов в неокрашенных образцах.

Количество автотрофов из не-ST окрашенной части затем вычитается из общего количества окрашенных кибер-частиц для определения обилия гетеротрофных микробов после выделения и очистки вирусоподобных частиц или используется эпифлуоресцентная микроскопия VLP для проверки наличия и чистоты вирусных частиц. На этих графиках представлены репрезентативные данные микробного метагенома. Относительное обилие синхронизации.

Occus SPP положительно коррелирует с процентом покрытия кораллов. В отличие от Ella Backer, SPP, метаболические пути для конъюгированного переноса положительно коррелировали с концентрациями нитратов. В то время как метаболический путь репарации ДНК был согласован между всеми метагеномами, в этой таблице представлены характеристики двух вирусных геномов, полученных с двух островов.

Во второй таблице приведены данные о химическом составе воды с различных участков во время одной экспедиции. После просмотра этого видео у вас должно сложиться четкое представление о том, как всесторонне оценить доступность органических и неорганических питательных веществ, а также численность и структуру вирусных и микробных сообществ в отдаленных полевых районах.