Измерение личинок деятельности в Drosophila Монитор активности

Общая цель этой процедуры — проанализировать активность личинок без использования сложного программного обеспечения для анализа видео. Это достигается путем предварительного переноса отобранных личинок в сетчатый фильтр для очистки от мусора. Далее отдельные личинки переносятся в пробирки для анализа, где они фиксируются шнековыми пробками, которые вставляются в монитор активности дрозофилы или устройство для плотины.

После трех-пяти минут акклиматизации из системы DAM снимаются записи для анализа. В конечном счете, измеренные с помощью матери движения личинок могут быть использованы для анализа различных параметров активности для данного генотипа. Одним из преимуществ этого метода по сравнению с существующими методами является то, что он автоматизирован и объективен.

Несмотря на то, что они достаточно просты для рутинных измерений активности, многие лаборатории уже имеют необходимое оборудование, которое можно легко адаптировать для использования на личинках. Демонстрировать процедуру будет Эйден Макфарлин, студент бакалавриата из моей лаборатории. В этом протоколе используется многолучевое устройство для мониторинга активности дрозофилы M five или плотина.

Установить дамбу. Сначала подключите монитор к интерфейсному блоку питания или PSIU с помощью телефонного кабеля CAB six. Затем подключите PSIU к розетке.

Зеленый свет укажет на подходящее подключение. В-третьих, подключите PSIU через USB-кабель к компьютеру для записи данных. Теперь установите и откройте на компьютере программу DAM системы MB one V six X.

Когда программное обеспечение открыто, оно автоматически начинает запись данных в систему управления программным обеспечением. Для плотины установите нужный интервал записи. Выберите настройки, а затем нажмите вверху или под опцией интервала чтения, чтобы выбрать различные таймфреймы, в которых будут храниться данные.

Существует множество других параметров, которые можно задать в разделе «Настройки» и «Тип выходных данных». Каждый параметр обеспечивает уникальный анализ активности личинок в трубке. Рекомендуется выбирать все параметры до начала сбора данных.

Если вы не уверены в том, какой параметр вы хотите измерить Для этого анализа, подготовьте пробирку с личинками для поиска пищи Для каждого генотипа, предназначенного для анализа. Используйте стандартную среду и корм для мух для приготовления пробирок для анализа. Налейте в чашку Петри 4%-ный шнековый раствор на глубину 1,5 сантиметра.

Это становится материалом пробки для пробирки, слишком плотным, чтобы в него можно было закопаться. Затем убедитесь, что трубки чистые и беспрепятственно промываем их горячей водой. Далее нагрейте отжимную бутылку со 100 миллилитрами воды в микроволновке в течение 10 – 15 секунд или до появления конденсата.

Затем переверните флакон и аккуратно выдавите теплый влажный воздух в пробирку для анализа. Когда на стенке трубки появляется тонкий слой конденсата, она достаточно влажная. Далее снимите гелевый диск с посуды и положите его на сетчатую поверхность, к которой он не будет плотно прилегать.

Чтобы собрать личинок, приготовьте сетчатый фильтр, натянув на воронку шелкотрафаретную капроновую сетку. Закрепите сетку у горловины воронки резинкой, а расположите воронку в стакане. Теперь зачерпните лопатку, полную корма, содержащего личинок для кормления, из бутылки с культурой и переложите их в сетчатый фильтр.

Смойте корм с личинок, используя воду комнатной температуры, из-под крана, отдельные личинки можно собрать с сетки с помощью кисти. Перенесите личинок примерно на 1,5 дюйма во влажную пробирку для анализа. Затем запечатайте трубку, закупорив ее шнеком.

Это делается путем вдавливания одного конца тюбика в гель дважды, а другого конца. Как только давление вытеснит одну из двух пробок на противоположном конце, по мере загрузки труб поместите их в плотину. Затем отрегулируйте положение каждой трубки так, чтобы животное не могло выйти за пределы диапазона датчиков.

Затем закрепите трубки на устройстве с помощью кольца из замазки. Запишите активность LARVAS в инкубаторе с температурой 20 градусов Цельсия, чтобы предотвратить неточные показания, которые могут возникнуть из-за теней, флуоресцентных ламп или колебаний температуры в лаборатории. В инкубаторе.

Используйте светодиодное освещение, не люминесцентное во время записи. Перед сбором данных дайте личинкам акклиматизироваться в течение пяти минут. Может быть полезно провести испытание без животных, чтобы убедиться, что условия освещения не срабатывают датчики DAM.

Через пять минут запустите предварительно настроенное программное обеспечение DAM, чтобы начать запись. Анализ может продолжаться в течение 30 минут без дополнительной конденсации или приема пищи. Важно, чтобы перед записью в настройках был выбран параметр активности, предназначенный для анализа.

Если этот вариант не выбран, он не будет доступен для апостериорного анализа. После того, как желаемое время записи будет завершено, закройте программное обеспечение DAM, данные автоматически сохраняются в папке данных системы плотины. Перенесите файл данных в отдельную папку, чтобы его можно было обработать позже.

Пробирки для анализа можно промыть кипятком для повторного использования. Чтобы обработать необработанные данные в понятный формат, откройте приложение для сканирования файлов DAM и выберите. Выберите папку входных данных, затем выберите папку с данными и нужный файл, а затем выберите опцию сканирования.

Наконец, выберите длину ячейки до желаемого периода считывания. При этом необработанные данные организуются в параметры, заданные оператором. Теперь выберите тип выходных данных для анализа желаемой настройки движения.

Если длина ячейки больше выбранного интервала считывания системы, перейдите в меню дополнительных показаний и выберите опцию две суммы в ячейки. Далее сохраните файл под соответствующим именем в той же папке, в которую были переданы исходные данные. Используя стандартную программу для работы с электронными таблицами, откройте сохраненный файл.

В зависимости от типа анализируемых данных, таблица должна читаться по-разному. Как правило, для измерения ходов или подсчета период времени исследования записывается в цифровом виде, в то время как каждая отдельная трубка для чтения получает специальную букву. Обычно столбцы от K до Z представляют слоты для пробирок для анализа, а строки представляют собранные точки данных.

Если, например, ходы собирались в течение 20 минут, то за одну минуту интервалы усредняют 20 строк для вычисления среднего количества ходов в минуту и других измерений. Исследование температурной реакции личинок третьего возраста штамма W 1 1 1 8 было проведено с использованием устройства мониторинга для выявления различий в личинках, локомоции. При семи различных температурах каждую личинку анализировали в течение 20 минут.

Очевидно, что личинки становились значительно более активными по мере того, как окружающая среда нагревалась. Для сравнения был протестирован гипоактивный мутант штамма W 1 1 18, названный неактивным. Анализ показал, что неактивные личинки были значительно менее подвижны, чем контрольная группа, чтобы проверить пределы обнаружения анализа.

Было проведено сравнение личинок на разных стадиях, когда у звездных личинок они были намного меньше, чем на третьей стадии. Активность первой и второй личинок звезд действительно можно было обнаружить и измерить, наблюдая за изменениями активности с течением времени в устройстве. Было обнаружено, что активность личинок третьих звезд в каждую минуту 20-минутного анализа оставалась относительно постоянной.

После освоения этот протокол обеспечивает точный, простой и экономически эффективный метод оценки основных параметров активности личинок в различных экспериментальных условиях.