Экс Vivo культуры глотки Арки для изучения Сердце и мышцы предшественников и свою нишу

Общей целью этой процедуры является изучение поддержания, миграции и судьбы сердечных и мышечных предшественников в мезодерме глотки. Это достигается путем предварительного рассечения глоточных дуг из только что собранного эмбриона мыши. Далее арки помещаются в пленку из медиа для облегчения их крепления.

Клетки, находящиеся внутри глоточного канала или мигрирующие из него, затем ежедневно контролируются. В конечном счете, отслеживание флуоресцентной линии на основе кри может быть использовано для отслеживания миграции, дифференцировки и обновления предшественников сердца и мышц в дугах глотки. Основное преимущество этой методики заключается в том, что она является единственной системой ex vivo для изучения обновляющейся популяции сердечных или мышечных предшественников и их микроокружения in vitro.

Демонстрация этого метода имеет решающее значение, поскольку родительские дуги у эмбрионов мышей в возрасте от 9,5 дней имеют размер всего от двух до 300 микрометров, что делает их очень сложными для идентификации и препарирования без предварительной визуализации. Перед началом процедуры. Coda 12, луночный планшет с PBS с добавлением 10% FBS.

Через час замените раствор покрытия на 200 микролитров бессывороточной среды на лунку. Закручивая пластину, убедитесь, что пленка из среды покрывает всю поверхность дна скважины. Затем опрыскайте и очистите брюхо усыпленной беременной мыши с 70% этанолом.

Затем с помощью стерильных инструментов сделайте разрез 0,5 сантиметра на морском участке. Возьмитесь за кожу выше и ниже разреза и аккуратно потяните в противоположных направлениях. Затем сделайте V-образный разрез в оболочке от пупка до яичников с каждой стороны живота, чтобы выявить матку.

Зажмите яйцевод, соединяющий матку с яичником, щипцами и яйцевод со стороны яичника ножницами, чтобы освободить матку от яичника. Аккуратно подтягивая матку вверх за укт. Разрежьте матку, освободив ее от области мочевого пузыря.

Затем подтяните матку дальше вверх за ОКТ и разрежьте УТК с другой стороны, освободив матку от брюшной полости. Переложите матку в трубку объемом 50 миллилитров, содержащую 20 миллилитров холодной, стерильной PBS с кальцием и магнием. Аккуратно встряхивайте трубку в течение 10 секунд, чтобы вымыть кровь.

Затем с помощью щипцов перенесите матку в 10-миллилитровую посуду и добавьте в ткани пять миллилитров холодного PBS. Затем под стереомикроскопом с помощью двух пар щипцов аккуратно вскройте матку и удалите амниотические мешочки, содержащие эмбрионы, по одному. Затем для каждого эмбриона по очереди сожмите и аккуратно удалите околоплодный мешок одной парой щипцов, используя другую пару, чтобы разрезать и освободить мешок от эмбриона.

Положите эмбрион на бок и с помощью щипцов разрежьте первую и вторую дуги сзади к сердцу между дугой и глоточным мешочком. После переворачивания эмбриона и разрезания дуги с другой стороны просто демонстрируется. Разрежьте сердечный выходной тракт, соединяющий дуги с эмбрионом, и удалите их.

Сожмите и освободите каждую из двух дуг глотки от оставшегося сердечного оттока и четырех кишечных энтодерм. В свою очередь, затем переносят ткани в центр отдельных лунок с покрытием 12 лунок, следя за тем, чтобы дуги не были покрыты средой. Чтобы облегчить прикрепление, инкубируйте дуги в условиях клеточной культуры.

Через два часа добавьте 200 микролитров 37 градусов Цельсия, свободную сыворотку по стенкам лунок, следя за тем, чтобы дуги оставались прикрепленными, и инкубируйте ткани в течение ночи. На следующий день визуально подтвердилось, что арки все еще прикреплены. Затем аккуратно добавьте в лунки еще 200 микролитров 37 градусов Цельсия свободной сыворотки среды.

Если ткани разлипаются и начинают плавать, аккуратно удалите среду пипеткой, не удаляя дуги, пока не останется только пленка среды. Затем с помощью наконечника пипетки переместите дуги обратно в середину лунки и снова инкубируйте ткани. Каждый второй день заменяйте любую выпаренную среду на 100-200 микролитров свежей, среды во время проявки.

Можно проследить предшественников лицевых мышц и сердца по мере того, как они пролиферируют и мигрируют из первой и второй дуги глотки, чтобы стать головной и сердечной мускулатурой соответственно. Культивирование дуг глотки предлагает уникальный способ детального изучения развития сердца и мышц ex vivo. С помощью системы CRE потомство мезодермы мышей может быть отслежено флуоресцентными репортерами по экспрессии Cree в течение 24–48 часов после культивирования ex vivo через 36–72 часа.

Образование кардиомиоцитов может быть визуально подтверждено спонтанно сокращающимися кластерами мигрирующих клеток внутри второй дуги, а также анализом специфических маркеров кардиомиоцитов. После трех-семи дней культивирования миотрубка и формирование лицевых мышц можно визуализировать в виде удлиненных и спонтанно сокращающихся клеток в пределах первой дуги, а также путем анализа специфических мышечных маркеров после ее развития. Этот метод проложил путь исследователям в области биологии стволовых клеток сердца и мышц к непосредственному мониторингу и изучению расширяющихся предшественников и их ниш in vitro.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как препарировать форальные дуги от развивающихся эмбрионов мыши до культивирования in vitro, которое позволяет изучать прогенеративное развитие сердца и мышц, ex vivo.