Микрожидкостных генипин осаждения Техника для расширенной культуры Micropatterned сосудистых мышечной тонких пленок

Мы представляем метод микрофлюидного осаждения узорчатого генипина и фибронектина на субстратах PDMS, позволяющий увеличить жизнеспособность тканей, плотных в гладкомышечных клетках сосудов. Этот метод изготовления тканей сочетается с предыдущей технологией тонких пленок сосудистых мышц для измерения сократительной способности сосудов в течение времени, связанного с заболеванием.

Общей целью этой процедуры является разработка in vitro модели сократительной функции гладких мышц, которая может быть использована для изучения механизмов сосудистых дисфункций, таких как церебральные вазоспазмы в масштабах заболевания, соответствующих заболеванию. Это достигается с помощью долговременных сосудистых мышечных тонких пленок путем предварительной подготовки эластомерных подложек путем последовательного нанесения покрытия на покрывающие листы с полоской пиама, за которым следует PDMS. Второй шаг заключается в использовании устройства для микрофлюидного осаждения для последовательного нанесения генина и фибронектина на поверхность.

Для того, чтобы дать ориентиры для самоорганизации тканей на сосудистых, мышечных тонких пленках, заключительным шагом является проведение анализа сократительной способности путем наложения сосудистых, мышечных тонких пленок, вызывающих сокращение и расслабляющее сокращение во время визуализации образца. В конечном счете, этот подход позволяет получить ткани, которые сохраняют структурную верность и функциональную сократимость в течение двух недель в культуре. Основное преимущество этой техники по сравнению с существующими методами, такими как микроконтактные мышечные тонкие пленки, заключается в том, что целостность тканей и функциональная сократимость сохраняются в течение нескольких недель, в то время как ткани, построенные с использованием предыдущих методов, начинают деградировать через три-четыре дня.

В культуре этот метод обеспечивает платформу для изучения ключевых вопросов сосудистых заболеваний, таких как изменение функциональной механики артерий во время прогрессирования хронического заболевания. Здесь мы изучаем сосудистую механику, но этот метод может быть применен и к другим модельным системам органов, таким как технологии чипов органов для рекапитуляции, функции сердца или скелетных мышц. Впервые идея этого метода пришла нам в голову, когда мы стремились изучить медленно развивающиеся сосудистые дисфункции и обнаружили, что современные методы либо не могут быть использованы для количественной оценки функции гладких мышечных клеток сосудов, либо не сохраняют целостность в течение достаточного периода времени.

Микрофлюидное осаждение Jin обеспечивает шаблон для самоорганизации клеток способом, аналогичным микроконтактной печати, но также позволяет тканям шаблона сохранять свою структуру и целостность в течение времени, подходящего для изучения сосудистого ремоделирования. Для начала очистки партии стеклянных покровных планок диаметром 25 миллиметров, как описано в сопроводительном текстовом протоколе, закройте края очищенных покровных планок, наложив на них клейкую ленту, оставив открытую полосу стекла в центре. Затем отрежьте защитные листы от формы и положите их по одному на патрон, покрытый отжимным покрытием.

С помощью щипцов добавьте 150 микролитров 10%-ного раствора поли Н изоп профиля. Акриламид, также называемый поли пам или пиамом, растворяется в одном бутаноле. Обязательно полностью закройте открытую область покровного стекла.

Затем включите спиннинг и увеличьте скорость на 10 секунд до 3000 об/мин. Подождите пять секунд, а затем увеличьте скорость в течение 10 секунд до 6 000 об/мин. Подождите при 6 000 об/мин в течение одной минуты, а затем снизьте скорость до 3000 об/мин в течение 10 секунд.

Удерживая его там в течение пяти секунд, прежде чем закончить цикл нанесения отжима. После высыхания осторожно снимите клейкую ленту со всех защитных накладок, оставив всю защитную пленку открытой с тонким слоем покрытия piam в центре стеклянной защитной пленки. Затем нанесите слой слоя Degas PDMS на каждую крышку.

Вставьте и высушите их в духовке при температуре 90 градусов Цельсия не менее 1,5 часов. Спроектируйте тканевую микрофлюидную фотомаску, а затем подготовьте образец кремниевой пластины, как описано в сопроводительном текстовом протоколе. После создания рисунка съешьте с помощью стандартных техник и положите ее лицевой стороной вверх в чашку Петри.

Затем смешайте и DGA 100 грамм PDMS С соотношением сшивающих агентов 10 к одному, полностью и равномерно покройте с рисунком. Поместите чашку в вакуумную сушку примерно на 30 минут, пока не будут удалены все пузырьки воздуха. Затем высушите PDMS в чашке при температуре 90 градусов Цельсия не менее 1,5 часов.

После отверждения отрежьте излишки PDMS и медленно отклейте оставшиеся PDMS с рисунком от стороны шаблона пластины. Отрежьте излишки PDMS вокруг узоров с помощью лезвия бритвы и сформируйте устройства в виде прямоугольников, чтобы облегчить извлечение устройства на последующих этапах. Затем используйте одномиллиметровый хирургический пробойник для биопсии, чтобы сформировать входное и выходное отверстия.

Ультразвук в микрофлюидных устройствах в 70% этаноле не менее чем за 30 минут перед каждым использованием. Поместите до 10 сосудистых мышц тонкопленочного покрытия субстрата в ультрафиолетовый озоночиститель на восемь минут. Затем приготовьте раствор генина в соотношении пять миллиграммов на миллилитр, добавив один миллилитр стерильной двойной дистиллированной воды в пятимиллиграммовую емкость лиофилизированного генина.

Смешайте раствор с помощью вихревого миксера и отставьте флакон при комнатной температуре не менее чем на 30 минут. Поместите очищенные микрофлюидные устройства стороной вниз на каждую крышку. Проскальзывайте по одному.

Плотно надавите на устройства, чтобы обеспечить плотное прилегание к покровным стеклам с покрытием PDMS. Быстро поместите каплю 70%-ного этанола на входное отверстие каждого устройства для заливки устройства. Через пять-10 минут осторожно откачайте избыток этанола на входе и немедленно замените его примерно 100 микролитрами PBS.

С помощью пылесоса пропустите PBS к выходному отверстию устройств, чтобы смыть этанол. Остановитесь, когда на входе останется лишь небольшое количество PBS. Затем поместите по 60 микролитров из пяти миллиграммов на миллилитр раствора генина на каждое входное отверстие, протяните раствор генина через устройства, заменив наконечник вакуумного аспиратора на выходе.

Прекратите всасывание, когда на входе останется лишь небольшое количество раствора. Затем поместите капли PBS на входе и выходе, чтобы предотвратить высыхание раствора. Во время инкубации переместите чашку с устройствами во увлажненную духовку или инкубатор, установленный на 37 градусов Цельсия, и инкубируйте в течение четырех часов.

Во время инкубации повторно суспендируйте фибронектин до концентрации 50 мкг на миллилитр в стерильной воде двойной дистилляции и поместите ее на лед не менее чем на 30 минут после инкубации с Цзинь. Прокачайте через или, но минимальное количество PBS на входе. Далее место, 100 микролитров 50 микрограмм на миллилитр раствора фибронектина.

На каждом входе втягивайте раствор через устройства с помощью наконечника вакуумного аспиратора. На выходе переместите открытую тарелку с устройствами в духовку или инкубатор, установленный на 37 градусов Цельсия, и выдерживайте в течение 24 часов. После инкубации осторожно извлеките приборы из покровных стеблей, медленно отклеивая прибор за угол, при этом слегка ухватившись за покровный листок в противоположной руке, поместите покровные листки в стерильные шесть лунок посуды.

Добавьте в каждую лунку не менее пяти миллилитров раствора пенициллина стрептомицина, а затем поместите посуду в стерильный инкубатор при температуре 37 градусов Цельсия не менее чем на 30 минут. После стерилизации аспирируют раствор пенициллина стрептомицина и засеивают покровные стекла культивируемыми клетками гладкой мускулатуры пупочной артерии человека в концентрации 80 000 клеток на квадратный сантиметр. Инкубируйте клетки при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа в течение не менее 24 часов до тестирования.

Чтобы начать тестирование, поместите образец ткани в 100-миллиметровую чашку. Добавьте стерильный подогретый раствор тиро при pH 7,4, чтобы покрыть образец. С помощью бритвенного лезвия производится несколько параллельных надрезов через лист ячейки перпендикулярно краю рукава трубы.

Делайте надрезы, которые дают более широкие участки ткани толщиной около двух миллиметров. Это будут сосудистые мышечные тонкие пленки, чередующиеся с тонкими полосками, которые будут удалены позже. Затем поверните блюдо на 90 градусов и сделайте два прямых параллельных надреза посередине ткани параллельно полоске пиама.

Удалите тонкие полоски между сосудистыми, мышечными, тонкими пленками, чтобы предотвратить контакт соседних пленок. Затем поместите чашку на платформу с регулируемой температурой на предметный столик стереомикроскопа и начните захватывать покадровые, проходящие и флуоресцентные изображения в течение всего анализа лечения. Последовательно обрабатывайте сосудистые мышечные тонкие пленки 50 наномолярами эндотелия, один в течение 20 минут для индуцирования сокращений, затем 100 микромоляров HA 10 77 в течение 30 минут для индукции расслабления при охлаждении до температуры ниже 32 градусов Цельсия.

Пиам растворяется, высвобождая сосудистые мышечные тонкие пленки. Измерение длины проекции может быть преобразовано в радиус кривизны, используется для расчета среднего напряжения в слое ячейки на показанной здесь пленке при последовательном прохождении световых изображений репрезентативного анализа сократительной способности. Эти изображения могут быть преобразованы в значения напряжения, из которых рассчитывается базальный тонус и индуцированная сократительная способность.

В этом видео показан репрезентативный временной интервал анализа полной сократимости. Мышечные тонкие пленки достигают сократительного равновесия, а затем сокращаются еще больше при добавлении 50 нила молярного эндотелия. Одна пленка расслабляется после добавления 100 микромоляров га 10 77.

Небольшое снижение базального тонуса и сократительной способности тканей в конце анализа, вероятно, является прямым результатом уменьшения количества клеток, составляющих ткань. Поскольку клетки гладких мышц сосудов, испытывающие сывороточный голод, не размножаются, здесь представлены фазово-контрастные изображения гладкомышечных клеток, выращенных на модифицированных генинами поверхностях в различные моменты времени жертвоприношения от одного дня до двух недель. Иммуногистохимия была использована для выявления слияния и клеточного выравнивания тканей путем окрашивания филаментов F-актина в зеленый цвет после одного, четырех и семи дней сывороточного голодания.

Количественная оценка слияния тканей в этом временном диапазоне показала минимальное ухудшение на этих поверхностях. Выравнивание f-актиновых филаментов было количественно определено, и было подтверждено, что выравнивание сохранялось в течение двух недель. В культуре, как только вы освоите эту технику изготовления тканей in vitro, это можно сделать за два дня.

При попытке использовать эту процедуру важно помнить о начале микрофлюидного осаждения за день до предполагаемого посева клеток и поддерживать постоянную физиологическую температуру во время экспериментов с ребристой пленкой. После этой процедуры можно использовать традиционные биохимические методы, такие как вестерн-блоттинг и ПЦР, для изучения изменений в экспрессии белков и генов для корреляции фенотипа клеток с функциональным поведением. Этот метод открывает исследователям путь к изучению прогрессирования медленно развивающихся сосудистых дисфункций, таких как церебральный вазоспазм, гипертония и атеросклероз, а также моделей артериальной стенки человека in vitro.