Деацетилирование Assays распутать Interplay между Sirtuins (SIRT2) и специфического белка-субстратов

Общая цель данного протокола заключается в проведении анализов деацетилирования in vitro и in vivo с целью установления роли белков в качестве специфических субстратов для деацетилирования сиртуинов. Несмотря на растущее число белков, признанных ацетилированными, что свидетельствует о широком распространении ацетилирования, специфические ферменты, регулирующие эти модификации, еще не идентифицированы для большинства этих белков. Основное преимущество этих анализов заключается в том, что путем установления белка в качестве законного субстрата специфической деацетилазы можно раскрыть новые роли и функции деацетилазы.

Хотя этот метод может дать представление об идентификации субстрата, специфичного для сиртуина 2, он также может быть применен, с незначительными модификациями, к другим членам семейства сиртуинов. Чтобы начать эту процедуру, приготовьте 10-сантиметровую чашку для культивирования HEK 293 Т-клеток в восьми миллилитрах DMEM, с 10% FBS в антибиотиках, чтобы клетки были примерно на 70% слитыми после роста в течение ночи. На следующий день котрансфектируйте клетки следующими препаратами: четыре микрограмма лентивектора, экспрессирующего GFP и меченный FLAG-мечкой SIRT2, четыре микрограмма упаковочного вектора и 0,5 микрограмма оболочечного вектора.

Используйте полиэтиленимин, или ПЭИ, в соотношении три микролитра ПЭИ на микрограмм ДНК. Через 12 часов после трансфекции смените среду. Через 36-48 часов соберите надосадочную жидкость.

Удалите мусор центрифугированием при 1000 г в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия. После фильтрации через фильтр 0,22 микрометра внесите в один миллилитр аликвоты лентивируса SIRT2 и храните при температуре минус 80 градусов Цельсия. Когда клетки будут готовы к заражению, разморозьте лентивирус SIRT2 на льду.

Инфицируйте шестилуночный планшет с 80-90% конфлюентными HEK 293 Т-клетками одним миллилитром лентивируса в присутствии восьми микрограммов на миллилитр полибрена. Поместите инфицированные вирусом клетки в инкубатор с температурой 37 градусов Цельсия на 24 часа. Через 24 часа замените среду.

Через 48 часов после заражения проверьте эффективность инфекции, обнаружив GFP-положительные клетки под флуоресцентным микроскопом. Если эффективность инфекции составляет от 40 до 50%, замените среду питательной средой, содержащей два микрограмма на миллилитр пуромицина, чтобы выбрать стабильные клетки с гиперэкспрессией SIRT2. Верните клетки в инкубатор.

Отбор стабильных клеток сверхэкспрессии SIRT2 займет около двух недель, и среду необходимо менять каждые три-четыре дня. Для очистки SIRT2 приготовьте не менее 10 10-сантиметровых тарелок из HEK 293 T-клеток, экспрессирующих FLAG SIRT2. Через 24 часа удалить питательную среду, дважды промыть клетки в PBS и собрать клетки методом трипсинизации с последующим центрифугированием при 1000 г в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия.

Лизируйте клеточную гранулу в 500 микролитрах лизисного буфера А на чашку, который включает коктейль ингибиторов протеазы и один микромоляр ТСЖ, ингибитора гистондеацетилазы третьего класса. Инкубировать в течение 30 минут при температуре четыре градуса Цельсия при постоянном вращении. Через 30 минут центрифугируйте при 14 000 г в течение 15 минут при четырех градусах Цельсия.

Переложите надосадочную жидкость в новую трубку. Проводят иммунопреципитацию с помощью антитела против FLAG, конъюгированного с шариками агарозы. Добавьте от 200 до 300 микролитров антитела против FLAG к лизату белка и инкубируйте при четырех градусах Цельсия при постоянном перемешивании в течение ночи.

На следующий день соберите иммунопреципитаты центрифугированием при 1000 г и четырех градусах Цельсия в течение пяти минут. Промойте гранулу пять раз с 10 миллилитрами буфера для лизиса А. После пятой промывки удалите надосадочную жидкость и добавьте в агарозные шарики 500 микролитров одного пептидного раствора X FLAG, который включает в себя коктейль ингибиторов протеазы и TSA. Инкубируйте при температуре четыре градуса Цельсия, при постоянном вращении, в течение 30 минут.

Соберите надосадочную жидкость центрифугированием при 6 000 г в течение двух минут при четырех градусах Цельсия. Удалите шарики агарозы из надосадочной жидкости с помощью фильтрующих трубок и центрифугирования при 15 000 г при четырех градусах Цельсия в течение одной минуты. Наконец, используйте ультрафильтрационную мембрану для концентрирования элюированного образца до тех пор, пока конечная концентрация белка не составит один микрограмм на микролитр.

Держите очищенный SIRT2 при температуре минус 80 градусов по Цельсию. Начните эту процедуру с подготовки 10 10-сантиметровых культуральных чашек из HEK 293 Т-клеток, чтобы на следующий день они были примерно на 70% слиты. На следующий день котрансфектируйте клетки пятью микрограммами меченного FLAG-инфектора плазмы, экспрессирующего белок-субстрат, и пятью микрограммами специфической ацетилтрансферазы, которая может ацетилировать белок.

Если конкретная ацетилтрансфераза неизвестна, используйте смесь известных гистон-ацетилтрансфераз. Используйте ПЭИ в соотношении три микролитра ПЭИ на микрограмм ДНК. Инкубируйте трансфицированные клетки в течение 12 часов.

Затем смените среду и инкубируйте клетки в течение 24 часов. Обрабатывайте клетки одним микромолярным ТСА и двумя миллимолярными никотинамидами в течение 12 часов, заменяя питательную среду средой, содержащей ТСА и никотинамид. Это позволит максимизировать уровни ацетилирования белкового субстрата за счет ингибирования деацетилаз.

Через 48 часов после трансфекции удалить питательную среду и дважды промыть клетки PBS. Соберите клетки методом трипсинизации с последующим центрифугированием при 1000 г в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия. Чтобы лизировать клеточную гранулу, добавьте 500 микролитров лизисного буфера А на чашку, который включает коктейль ингибиторов протеазы, один микромолярный TSA и два миллимолярных никотинамида, и инкубируйте при четырех градусах Цельсия при постоянном вращении в течение 30 минут.

Центрифугируйте при 14 000 г в течение 15 минут при четырех градусах Цельсия и перенесите надосадочную жидкость в новую пробирку. Проведите иммунопреципитацию с использованием антитела против FLAG, конъюгированного с шариками агарозы, как описано в текстовом протоколе. После концентрирования элюированного образца до одного микрограмма на миллилитр, поддерживайте температуру очищенного ацетилированного белка-субстрата при температуре минус 80 градусов Цельсия.

Важным шагом в этом протоколе является подтверждение очистки ацетилированного белка-субстрата белком с использованием белок-специфического антитела и антитела против ацетилирования до реакции деацетилирования in vitro. Перед началом реакции деацетилирования in vitro приготовьте буфер для деацетилирования B. Затем приготовьте три реакции в трех разных пробирках, каждая из которых имеет общий объем 20 микролитров, как показано в этой таблице. Все три пробирки содержат очищенный ацетилированный белок-субстрат и буфер деацетилирования B, но вторая пробирка также содержит очищенный SIRT2, а третья пробирка также содержит очищенные SIRT2 и NAD plus.

Для подтверждения деацетилирования белка-субстрата SIRT2 может быть включена необязательная четвертая реакция, в которой вместо активного деацетилазного SIRT2 добавляется очищенный нуль-мутант деацетилазы SIRT2. Инкубируйте реакции при температуре 30 градусов Цельсия при постоянном перемешивании в течение трех часов. Остановите реакцию, добавив 20 микролитров двух буферов для образцов X в каждую пробирку, и прокипятите образцы при температуре 95 градусов Цельсия в течение 10 минут.

Затем реакционные смеси прогоняют на странице от 4 до 12% SDS, и определяют статус ацетилирования белка-субстрата с помощью вестерн-блоттинга с использованием антитела против ацетилированного лизина. Используя этот протокол, SIRT2 дикого типа и мутант с дефектом деацетилирования SIRT2 Hi87Y были очищены в конечной концентрации один микрограмм на микролитр. Поскольку оба белка помечены пептидом FLAG, очищение может быть подтверждено иммуноблоттингом с использованием антител против FLAG.

Белок-субстрат и ацетилированный белок-субстрат также очищали. Иммуноблоттинг с использованием антител против ацетиллизина подтвердил повышение ацетилированных уровней очищенного белка в клетках, гиперэкспрессирующих ацетилтрансферазы. Общие белки были обнаружены с помощью антитела против FLAG.

В анализе деацетилирования in vitro, когда очищенный ацетилированный белок-субстрат инкубировали с SIRT2 дикого типа или мутантом с дефектом деацетилирования в присутствии NAD plus, сниженные уровни ацетилированной кислоты обнаруживали с помощью иммуноблоттинга с использованием антитела против ацетиллизина в присутствии SIRT2, но не в присутствии мутанта. Активность деацетилирования не наблюдалась, когда NAD plus не был включен в реакционную смесь, что подтверждает, что SIRT2 требует NAD plus для своей ферментативной функции. Деацетилирование также ингибировалось при добавлении в реакционную смесь ингибитора сиртуина, NAM, что означает, что снижение ацетилированных уровней белка опосредовано активностью деацетилазы SIRT2.

Для того, чтобы белок можно было рассматривать в качестве мишени для деацетилирования для любого фермента, необходимо провести анализ деацетилирования как in vitro, так и in vivo, чтобы установить взаимодействие между деацетилазой и каждым субстратом. Анализ деацетилирования in vivo в клетках в определенных экспериментальных условиях может дать дополнительное представление о взаимодействии между деацетилазой и потенциальным субстратом в физиологических и патофизиологических сценариях, а также установить функциональную роль события деацетилирования в физиологическом контексте. Учитывая растущий интерес к роли сиртуинов в регуляции различных клеточных процессов, описанные анализы деацетилирования могут быть использованы с небольшими модификациями для идентификации новых субстратов для других членов семейства сиртуинов, независимо от их субклеточной локализации.

Анализы деацетилирования in vitro и in vivo, проводимые с помощью специфических деацетилаз, могут быть дополнительно объединены с мелкомасштабным масс-спектрометрическим анализом для выявления лизинов-мишеней на субстрате для отличия сайтов функционального ацетилирования от нерегуляторных ацетилированных лизинов.