Данио рерио в качестве модели для оценки тератогенных потенциал Нитрит

Общая цель этой процедуры заключается в лечении эмбрионов рыбок данио нитритами и определении их тератогенного эффекта. Этот метод может помочь ответить на некоторые ключевые вопросы в области токсикологии развития, такие как оценка тератогенного воздействия химических веществ на эмбриональное развитие. Главное преимущество этой процедуры заключается в том, что в ней используются эмбрионы данио-рерио, которые развиваются внешне и могут наблюдаться под микроскопом.

Для экспериментов, показанных здесь, поддерживайте дикие штаммы данио-рерио, такие как штамм Тюбингена, при температуре 28,5 градусов Цельсия и цикле свет-темнота в течение 14 часов и 10 часов соответственно. В ночь перед сбором икры добавьте воду и разделители для рыб в резервуары для спаривания и поместите самцов и самок рыб по разные стороны разделителя. Для того, чтобы было получено достаточное количество икры, засаживают 30 пар рыб.

На следующее утро, после того как загорится свет, снимите перегородки, чтобы начать спаривание. Проверяйте брачные емкости на наличие яиц каждые 15 минут. Как только рыбы отложат икру, используйте ситечко для чая, чтобы собрать эмбрионы и объединить их все в большой контейнер с буфером E3.

Инкубируйте яйца при температуре 28,5 градусов Цельсия. Через 1,5 часа после оплодотворения, или HPF, под препарирующим микроскопом используйте пластиковую переводную пипетку, чтобы отбросить неоплодотворенные яйцеклетки, которые будут казаться непрозрачными. Перенесите по 50 эмбрионов в стеклянные чашки Петри размером 100 на 15 миллиметров, содержащие 50 миллилитров буфера Е3 в трех экземплярах для каждого условия лечения.

Например, для 11 лечебных состояний приготовьте 33 блюда по 50 эмбрионов в каждом. В три чашки Петри эмбрионов при 2 HPF удаляют буфер Е3 и добавляют 50 миллилитров 300 миллимолярного этанола, разведенного в буфере Е3. Накройте посуду парапленкой, чтобы свести к минимуму испарения этанола.

Инкубируйте эмбрионы в этаноловом буфере в течение 22 часов при температуре 28,5 градусов Цельсия, затем удалите раствор и используйте буфер E3 для вымывания этанола, несколько раз переворачивая чашку. Повторите стирку еще два раза. В 3 чашки Петри из зародышей по 2 HPF удаляют Е3 и заменяют 50 миллилитров свежего Е3. Для девяти чашек Петри при 2 HPF удалите Е3 и добавьте 50 миллилитров 1000 мг на миллилитр нитрита натрия, растворенного в Е3, и инкубируйте при 28,5 градусах Цельсия, ежедневно заменяя раствор нитрита натрия.

Через 46 часов удалите три из девяти пластин с нитритами натрия, удалите раствор и используйте буфер E3 для промывки пластин три раза. Через 24 часа удалите три разные пластины с нитритами натрия из инкубатора, удалите раствор и используйте свежий буфер E3 для промывки эмбрионов три раза. Через 24 часа выполните аналогичные действия для промывки последних трех пластин

Затем для другого набора из трех чашек Петри замените буфер E3 на 200 миллиграммов на миллилитр нитрита натрия, затем установите группы из трех чашек по 50 эмбрионов в каждой с 400, 600, 800 и 1000 миллиграммами на миллилитр нитрита натрия. Инкубируйте эмбрионы в течение 70 часов, ежедневно заменяя раствор нитрита натрия. После инкубации удалите раствор из пластин, и используйте буфер Е3, чтобы трижды промыть пластины.

Для еще трех чашек Петри эмбрионов замените буфер Е3 на 50 миллилитров 1000 миллиграммов на миллилитр нитрата натрия в буфере Е3. После выдержки эмбрионов в течение 70 часов используйте E3 для промывания эмбрионов, как было показано ранее. В течение каждого дня воздействия под стереомикроскопом подсчитывают количество мертвых эмбрионов, обращая внимание на отсутствие сердцебиения и кровообращения или на отсутствие подвижности после одной минуты наблюдения.

Удалите мертвые эмбрионы. В конце экспериментов, чтобы усыпить личинок, с помощью передаточной пипетки удалите буфер Е3, затем добавьте 50 миллилитров 0,2% MS-222 и выиграйте в течение 10 минут. После одной промывки E3 удалить MS-222, оставив некоторый объем для правильного пипетирования эмбриона, добавьте личинки до 4% PFA, покрутите чашку несколько раз и с помощью переводной пипетки поместите личинки в стеклянный флакон с достаточным количеством PFA, чтобы заполнить флакон

Затем закрепите личинок в холодильнике на ночь. После фиксации используйте стереоскоп и цифровой фотоаппарат при 30-кратном увеличении, чтобы сфотографировать личинок. Сориентируйте личинок так, чтобы передняя часть была слева, а спинная поверхность — в верхней части поля.

Воздействие 300 миллимолярного этанола в течение 22 часов не оказало влияния на выживаемость, что согласуется с предыдущими результатами. Как показано здесь, наблюдаемые фенотипы включали отек перикарда и отсутствие раздувания плавательного пузыря. Дефекты черепа на лице и задержка развития также наблюдались и здесь не показаны.

Лечение нитритами натрия приводило к легким или тяжелым последствиям для выживаемости, в зависимости от концентрации, при этом более высокие концентрации нитрита натрия приводили к снижению выживаемости. Этот рисунок показывает, что при более высоких концентрациях, таких как 1000 мг на миллилитр, более длительное время инкубации также оказывает более серьезное влияние на выживаемость. Наконец, как показано здесь, в отличие от рыб, обработанных нитратами, личинки, обработанные нитритами, имеют дефекты развития.

После освоения этой техники ее можно выполнить за 3 часа, и важно помнить о ежедневном удалении эмбрионов, чтобы свести к минимуму загрязнение. После этой процедуры можно использовать другие методы, такие как гибридизация in situ, для оценки экспрессии генов. Этот метод предназначен для исследователей для изучения тератогенного потенциала химических веществ в развитии рыбок данио.