Проектирование, Упаковка и доставка высокий титр CRISPR Retro и Лентивирусов через стереотаксической инъекции

Общая цель этой процедуры состоит в том, чтобы позволить исследователям разрабатывать и упаковывать вирусы, экспрессирующие флуоресцентный белок, CAS9 и sgRNAs, а затем вводить их стереотаксически в мозг мыши. Этот метод может помочь ответить на конкретные вопросы в области нейробиологии, такие как роль генов, лежащих в основе неврологических расстройств и нарушений развития нервной системы. Основным преимуществом этой методики является возможность манипулировать конкретными генами без трудоемкого и ресурсоемкого процесса создания генетически модифицированных животных.

Перед подготовкой клеток используйте веб-сайт для создания 20-нуклеотидной направляющей цепи или sgRNA, которая будет использоваться для создания одноцепочечных олигону. После заказа олигоплазм и использования их для создания окончательной плазмиды, как описано в текстовом протоколе, продолжайте пипетирование всех th-od клеток из криопробирки в коническую пробирку объемом 15 миллилитров. Далее добавьте 2 миллилитра предварительно подогретого CO2 уравновешенного полного IMDM.

Затем центрифугируйте клетки в течение пяти минут при 500-кратном G. После этого аспирируйте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клеточную гранулу в 10 миллилитрах полного IMDM. Поместите клетки на 10-сантиметровую чашку для клеточных культур и инкубируйте их в течение ночи при температуре 37 градусов Цельсия в инкубаторе с 5% углекислым газом. Через 24 часа после нанесения покрытия смените среду, отасунув существующую среду и добавив 10 миллилитров предварительно подогретого IMDM.

Разделите клетки, как только они сольются. Чтобы расщепить клетки, аспирируйте среду и промойте пластину 5 миллилитрами PBS. Затем добавьте в тарелку один миллилитр 0,25% трипсина и инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия, пока клетки не оторвутся от пластины.

После этого добавьте 0,5 миллилитра IMDM, чтобы нейтрализовать реакцию трипсина, и пипетируйте клетки в 1,5-миллилитровую пробирку. Далее вращайте ячейки со скоростью, умноженной на 500 G, в течение пяти минут. Ресуспендируйте клетки в одном миллилитре IMDM и разведите 10 микролитров клеток в 90 микролитрах PBS.

Подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра или автоматического счетчика клеток и повторно заплатите клетки с помощью полного IMDM. На пятый день смените среду за два часа до трансфекции и убедитесь, что в 10-сантиметровой пластине ровно 10 миллилитров среды. Далее приготовьте реагенты для трансфекции на две дистанции с помощью двух пятимиллилитровых полистирольных трубок с круглым дном.

Пометьте первую пробирку как ДНК, а вторую пробирку как 2X HBS. Затем отрегулируйте концентрацию ДНК до одного микрограмма на микролитр в Tris EDTA при PH 7,4. Чтобы сделать реагенты для трансфекции лентивирусов и ретровирусов, медленно добавляйте необходимые компоненты в пробирку, меченную ДНК, непрерывно постукивая по пробирке для смешивания.

После этого добавьте один миллилитр 2X HBS в тюбик с маркировкой 2X HBS. Затем медленно добавьте один миллилитр содержимого из пробирки ДНК в пробирку 2X HBS, по одной капле за раз. Непрерывно постукивайте по трубке 2X HBS и наблюдайте за осадком фосфата кальция, образующимся после каждой капли, чтобы обеспечить успешное создание трансфекционных комплексов.

Впоследствии выдержите трубку в темноте в течение 30 минут при комнатной температуре. Через 30 минут добавьте один миллилитр реагента для трансфекции медленными каплями в каждую 10-сантиметровую клеточную пластину и инкубируйте клетки в течение ночи при температуре 37 градусов Цельсия. Замените носитель на шестой день.

На седьмой день перенесите среду, содержащую вирусные частицы, с помощью серологической пипетки объемом 10 миллилитров в коническую пробирку объемом 50 миллилитров перед хранением при температуре четыре градуса Цельсия. Затем добавьте восемь миллилитров среды 0,5% FBS в каждую клеточную пластину. На восьмой день соберите клеточную среду, содержащую вирусные частицы, и объедините ее с собранным накануне продуктом в конической пробирке объемом 50 миллилитров.

На этом этапе центрифугируйте вирусный надосадочный продукт при 2000-кратном G в течение 10 минут. После этого очистите вирусную среду, отфильтровав ее через шприцевой фильтр с низким содержанием связывания белка размером 0,45 микрометра. Далее добавьте в среду 5Х раствор полиэтиленгликоля 6000

Переверните трубку несколько раз для перемешивания. Затем инкубируйте вирусную смесь при температуре четыре градуса Цельсия не менее 12 часов. На девятый день центрифугируйте вирусную смесь при 2500 умноженных на G в течение 45 минут.

Через 45 минут выбросьте надосадочную жидкость и снова крутите ее в течение двух минут. Затем следует снова удаление надосадочной жидкости. После этого повторно суспендируйте гранулу, добавив 320 микролитров стерильного PBS, и инкубируйте в шейкере при комнатной температуре в течение 30 минут.

На следующий день заморозьте вирус при температуре минус 80 градусов по Цельсию. Чтобы начать эту процедуру, побрейте голову мыши, находящейся под наркозом, чтобы подготовиться к месту инъекции. Направьте 4%-ный изофлуран в носовой конус.

Далее поместите мышь в стереотаксический инструмент. Вставьте прикусную планку в рот до тех пор, пока зубы не опустятся в прорезь, прежде чем закрепить ушные планки. Убедитесь, что тело животного находится на грелке, а нос расположен в носовом конусе

Далее подтвердите анестезию, дав пощипывание ноги. Затем нанесите искусственные слезы для смазки глаз. Впоследствии смахните с бритой головы повидон-йодом и лидокаином.

Теперь сделайте небольшой разрез по средней линии кожи головы. Высушите череп тампоном и нанесите перекись водорода, чтобы помочь визуализировать брегму. С помощью препарирующего эндоскопа найдите брегму на черепе и поместите сверло над ней.

Установите цифровые стереотаксические координаты плоскостей X, Y и Z равными нулю. Для того чтобы убедиться, что головка выровнена по ростральной каудальной оси Y, поместите сверло на лямбду и выровняйте головку так, чтобы координата Z была примерно равна нулю в точках брегмы и лямбды. Чтобы убедиться, что головка выровнена по оси X, поместите сверло в среднюю точку между брегмой и лямбдой и измерьте координаты Z на расстоянии одного миллиметра от средней точки с обеих сторон, чтобы убедиться, что они равны.

Затем опустите изофлуран до 2%, прежде чем поместить сверло по нужным координатам и тщательно просверлите череп. Просверлив все отверстия, прикрепите шприц, наполненный вирусом, к стереотаксическому инструменту. Центрируйте шприц над отверстием и установите координату Z на черепе равной нулю.

Медленно опустите шприц на наибольшую глубину Z и начните инъекцию со скоростью 0,25 микролитра в минуту с помощью стереотаксического инжектора. После того, как инъекция будет завершена на самой большой глубине Z, подождите одну минуту, прежде чем поднимать ее до следующей координаты, и начните инъекцию снова. Продолжайте использовать этот шаблон до тех пор, пока не будут введены все координаты внедрения Z.

После последней инъекции подождите две минуты, прежде чем извлекать шприц. Затем снимите мышку со стереотаксического инструмента и зашите волосистую часть головы. Нанесите лидокаин и антибактериальный крем на область операции и введите обезболивающее лекарство перед переводом животного в отапливаемую камеру восстановления.

Это 10-кратное широкопольное флуоресцентное изображение продемонстрировало, что ретровирусы с высоким титром инфицируют большое количество клеток, морфологию которых можно оценить с помощью экспрессии флуорофора. В этом примере вирусы, экспрессирующие GFP или mCherry, были коинъецированы в зубчатую извилину. Используя систему ретровирусов, можно использовать один вирус для проведения одной генетической манипуляции, помеченной GFP, и другой манипуляции, помеченной mCHerry, а затем оценить единичные или аддитивные изменения, вызванные каждым вирусом.

Это 3D-реконструкция объема инъекции, в которой были прослежены замкнутые контуры распространения вируса на 21 серийном срезе. Затем контурные контуры были выровнены для создания 3D-изображений для количественной оценки объема. Общее распространение вируса показано зеленым цветом, а локализованное распространение дендат — фиолетовым.

На этом изображении показано, как вирус распространяется по дорожке иглы и мозолистому телу в дополнение к заполнению ростральной каудальной оси зубчатой извилины. После инъекции вируса in vivo мы используем другие методы, такие как гистология, электрофизиология или живая двойная микроскопия, чтобы изучить влияние генетических манипуляций на развитие нейронов.