Оптический мониторинга живых нервных окончаний в Маркировки волосяной фолликул ланцетные окончаниями Ex Vivo Мышь уха кожи

Общая цель этого нового экспериментального протокола состоит в том, чтобы продемонстрировать доступность волосяных фолликулов в ухе мыши для исследования функции полностью дифференцированных механосенсорных нервных окончаний. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области механосенсорной нейробиологии, такие как роль синаптических везикул в механических ощущениях. Два основных преимущества этого метода заключаются в том, что он является быстрым и обеспечивает легкий оптический доступ к бесчисленным живым полностью дифференцированным механосенсорным нервным окончаниям.

Как правило, люди, плохо знакомые с этим методом, могут испытывать трудности с отделением кожи и адекватным очищением хряща без повреждения фолликулов. Помимо демонстрации базовой техники, здесь мы также покажем пример эксперимента, в котором рассматривалась кальциевая зависимость жизненно важной части функции нервного конца. Наполните 50-миллиметровую посуду, выстланную силиконом, раствором Лили или другим физиологическим раствором.

Обновляйте раствор каждые 15 минут, или используйте постоянную перфузию. После обезглавливания молодой взрослой мыши, используя ножницы, удалите внешние уши у основания, чуть выше плотной линии волос, и перенесите ушные раковины в чашку. Теперь приколите ухо вогнутой стороной вниз по краям с помощью тонких булавок от насекомых.

Затем осторожно снимите обнаженную заднюю часть кожи с помощью тупого рассечения. С помощью щипцов No 3 захватите центральную заднюю часть кожи, а другой парой щипцов проткните промежуток между кожей и хрящом у основания уха. Аккуратно проведите щипцами из стороны в сторону в пределах щели, постепенно разделяя передний и задний слои кожи.

Систематически двигайтесь по центральному хрящу к тонким свободным от хряща краям. Для этого потребуется практика. После удаления задней кожи приколите ее дермальной стороной вверх, рядом с передней кожей.

После удаления хряща на обоих препаратах кожи удалите слой пенистого фиброэластического хряща, который покрывает основание волосяных фолликулов. Аккуратно очистите, ощипайте и сотрите эту салфетку. Для этого также потребуется практика.

Удаление слишком большого количества красителя препятствует красителю и его визуализации, в то время как удаление слишком большого количества повреждает нервные окончания. Использование молодой мыши сводит к минимуму адгезию между передним и задним слоями кожи и сложность удаления нижележащего хряща. Оба эти фактора повысят вероятность успешного окрашивания.

Каждый препарат кожи может быть разрезан пополам от верхушки до основания, чтобы максимизировать количество репликантов и свести к минимуму использование животных. В этом разделе описано, как окрашивать ткани FM1-43, но он должен работать с большинством других стирилпиридиниевых красителей этого класса с подходящей регулировкой концентраций. Выполняйте эту процедуру при минимальном уровне окружающего освещения.

Перед началом внесите достаточное количество свежего 10 микромоляров FM1-43 в соответствующем газообразном физиологическом растворе на 3 миллилитра на один препарат. Выложите каждое блюдо в отдельную 35-миллиметровую посуду, выстланную силиконом, с 2 миллилитрами соответствующего физиологического раствора. Чтобы сравнить способность кальция и бария поддерживать поглощение красителя, инкубируйте в отдельных чашках с этого момента.

Положите немного в нормальный 2 миллимоляра кальция Liley, а другие в Liley's, где барий заменяет кальций. Затем поместите открытое блюдо на слегка погруженную платформу в водяную баню при температуре 30 градусов Цельсия. Глубина воды должна быть достаточной, чтобы согреть ткани, не проливая в посуду.

В каждую чашку прикрепите тонкую газовую магистраль к силиконовой основе, чтобы газ из продуктов составлял около 10 пузырьков в секунду. Также подогрейте растворы FM1-43 и 100 миллилитров безкрасящего физиологического раствора в плотно закрытых бутылках. Дайте всему уравновеситься до 30 градусов по Цельсию, а через 30 минут замените безкрасящий физиологический раствор на ткани с помощью соответствующего подогретого раствора.

Инкубируйте еще 30 минут. После инкубации слейте физиологический раствор без красителей и быстро и осторожно промокните всю оставшуюся жидкость вокруг препарата. Будьте осторожны, не прикасайтесь к открытым дермальным поверхностям.

Верните препараты на водяную баню, удерживая линии газообразования на месте. Теперь добавьте от 2 до 3 миллилитров теплого раствора красителя, содержащего кальций или барий. Через 40 минут верните ткани к комнатной температуре до конца процедуры, чтобы подавить повторное высвобождение введенного внутрь красителя.

Теперь удалите неинтернализованный краситель в три этапа:Во-первых, слейте раствор для маркировки и быстро промойте ткани три раза физиологическим раствором комнатной температуры в быстрой последовательности, а затем дайте им инкубироваться в течение 30 минут, чтобы удалить большую часть оставшегося красителя с поверхностных мембран. Наконец, удаляют стойкий краситель, прилипший к наружному листку открытых мембран, путем хелатирования препарата сульфированным производным b-циклодекстрина, состоящим из кальция или бариевого солевого раствора, в зависимости от обстоятельств. Таким образом, весь оставшийся краситель будет находиться внутри тканей.

После хелатирования верните заготовки в соответствующий свежий солевой раствор без красителей и тщательно высушите посуду снаружи папиросной бумагой. Затем сфотографируйте их как можно скорее. Продолжайте работать при минимальном внешнем освещении.

Перед получением изображения с помощью стереомикроскопа удалите поверхностные загрязнения, которые могут автоматически флуоресцентировать и загрязнить изображения. Затем поместите чашку под вертикальный эпифлуоресцентный микроскоп со стандартным набором фильтров флуоресцеина. Затем ослабьте интенсивность возбуждающего света с помощью фильтров нейтральной плотности до тех пор, пока препарат не будет освещен ровно настолько, чтобы удобно расположить нервные окончания.

Полное освещение довольно быстро убьет нервные окончания. Обнаружив их, сделайте снимки помеченных ланцетных клемм с помощью 10-кратного сухого объектива или 20-кратного объектива для погружения в воду. Сведите к минимуму интенсивность света и время экспозиции, используя время интеграции камеры от 1/2 до 1 секунды.

Для каждого препарата изобразите около 20 ланцетных окончаний, начиная с края, наиболее удаленного от разреза края основания кожи ушной раковины, и, работая вдоль этого края, визуализируя каждый фолликул по очереди. Работайте в слегка перекрывающихся полях, параллельных краю разреза, без визуализации одного и того же фолликула дважды или визуализации явно поврежденных фолликулов. После завершения краевой полосы переместите одну ширину поля к основанию ушной раковины и повторите процесс в обратном направлении.

Анализ описан в текстовом протоколе. После визуализации первой чашки, показывающей фолликулы, помеченные кальцийсодержащим физиологическим раствором, визуализируйте фолликулы в барийсодержащем физрастворе. Продолжайте в том же духе.

Убедитесь, что визуализация оставшихся контрольных и экспериментальных тканей согласована по времени, так как после мечения краситель впоследствии будет снова высвобождаться в группе экзоцитоза конститутивной рециркуляции SLV. При типичном препарате ушной раковины волосяные фолликулы легко видны при трансиллюминации без флуоресценции, что иллюстрирует тонкую природу препарата и относительную легкость доступа, которую он обеспечивает этим механосенсорным терминалям. При эпифлуоресценции меченые ланцетные окончания, окружающие каждый волосяной фолликул, четко видны и демонстрируют типично сильное спонтанное поглощение FM1-43.

Точечный узор отражает окончания, наблюдаемые в оптической плоскости, ортогональной коже, по длине вывода. Одним из многих применений этого метода является изучение кинетики экзоцитоза. Как и ожидалось, если поглощение красителя происходит из-за переработки везикул, на верхних панелях видно, как клемма с маркировкой самопроизвольно удаляет пятна.

После применения мощного стимулятора экзоцитоза, альфа-латротоксина, ускоряется естественный процесс удаления окрашивания, как видно на двух нижних панелях. Еще одно применение, как показано на видео, заключается в исследовании кальциевой зависимости эндоцитоза. Отчетливое поглощение красителя наблюдалось для ланцетных окончаний как в кальций-, так и в барийсодержащих солях.

При количественной оценке интенсивности флуоресценции терминального мечения во время видео не было обнаружено существенной разницы в поглощении красителя. Это указывает на то, что эндоцитоз одинаково хорошо поддерживается барием и кальцием. Дальнейшие повторения процедуры на других препаратах для уха проверят этот вывод.

После освоения весь этот протокол и визуализация могут быть завершены за два с половиной часа. При попытке выполнить эту процедуру важно помнить о том, что нужно использовать маленьких мышей, быстро препарировать и максимально адаптироваться к темноте, чтобы свести к минимуму необходимую интенсивность света. Мы позаимствовали идею этого метода из метода, первоначально разработанного его близким коллегой и ныне вышедшим на пенсию профессором Кларком Слейтером и его студентом магистратуры Майклом Кейном.

Когда мы рассказали им о возможной роли синаптических везикул в механоощущениях в мышечном веретене, но о необходимости лучшего способа визуализации, чем с помощью FM1-43. Эта процедура также может использоваться в сочетании с другими методами, такими как фармакология и электрофизиология. Затем мы сможем изучить, как регулируется рециркуляция синаптических везикул, и как это связано с отзывчивостью механосенсорных окончаний.