Экстракорпоральное культуры эпикардиального клеток из эмбриональных сердца

Общая цель этой культуры эксплантов заключается в том, чтобы облегчить культивирование эмбриональных клеток эпикарда, чтобы облегчить изучение роли специфических генов в биологии эпикардиальных клеток. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области сердца, такие как как клетки эпикарда способствуют развитию сердечно-сосудистой системы, заболеваниям и регенерации? Основное преимущество этого метода заключается в том, что он позволяет проводить долгосрочное культивирование высокочистой популяции эпикардиальных клеток.

Как правило, люди, плохо знакомые с этим методом, испытывают трудности, потому что изоляция желудочков требует такой точности, которая приходит только с практикой. Чтобы извлечь эмбриональные желудочки, начните с помещения беременной мыши на 12,5-й день эмбриона в положение лежа на спине на столе для препарирования и продезинфицируйте брюшную полость с помощью 70% этанола. Приподнимая кожу над животом, сделайте разрез в один-два сантиметра по средней линии.

Затем потяните за обе стороны разреза, чтобы открыть брюшную стенку, и разрежьте стенку, чтобы обнажить маточный рог. Затем с помощью стерильных щипцов приподнимают рог вверх и осторожно срезают жировую ткань и кровеносные сосуды, прикрепленные к рогу. Сделайте окончательный надрез на шейке матки, чтобы извлечь матку, и поместите маточный рог в чашку Петри, содержащую холодный, стерильный PBS.

Аккуратно промойте ткань и поставьте чашку петри на лед. С помощью ножниц разрежьте среднюю линию маточного рога на стороне, противоположной плаценте, чтобы обнажить эмбрионы. Затем с помощью стерильных щипцов разрежьте желточный мешок эмбриона, чтобы освободить эмбрионы, помещая каждый эмбрион в новую чашку Петри, содержащую холодный, стерильный PBS по мере его сбора.

После обезглавливания, для каждого эмбриона по очереди, разрежьте грудную стенку, чтобы обнажить сердце. С помощью стерильных щипцов приподнять сердце и хорошо вырезать сосуды, крепящие сердце к грудной клетке. Затем обрежьте выходной тракт и оба предсердия от каждого сердца и поместите желудочки в новую посуду с холодным PBS на льду.

Чтобы культивировать эпикардиальные экспланты на предметных стеклах стеклянной камеры, добавьте 500 микролитров питательной среды эпикардиального экспланта в каждую лунку предметного стекла с восемью лунками и засейте по одному иссеченному желудочку рассеченной стороной вниз в центр каждой лунки. Затем аккуратно поместите планшет в инкубатор для клеточных культур на 48–72 часа, чтобы экспланты прилипли к поверхностям предметного стекла камеры. Для дифференцировки эпикардиальных клеток в гладкомышечные клетки культивируют монослой эпикарда в среде для дифференцировки в течение еще шести дней.

Чтобы культивировать эпикардиальные клетки на коллагеновом геле, сначала смешайте соответствующий объем коллагенового раствора с пятью x DMEM с помощью пипетирования. Раствор пожелтеет. Далее добавьте соответствующий объем нейтрализующего раствора при перемешивании.

Раствор должен окраситься в розовый цвет. Теперь перелейте по 100 микролитров раствора коллагена в каждую лунку 96-луночного планшета и поместите планшет в инкубатор для клеточных культур, чтобы гель полимеризовался. Через 30-60 минут добавьте по 200 микролитров питательной среды эпикардиального экспланта в каждую лунку и перенесите иссеченный желудочек рассеченной стороной вниз в центр каждой лунки.

Аккуратно поместите планшет в инкубатор для клеточных культур на трое суток. На третий день удалите желудочки и верните пластину в инкубатор еще на двое суток. После 48-72 часов культивирования наложение красных флуоресцентных белковых иммунофлуоресцентных изображений и изображений яркого поля показывает, что большинство клеток, мигрирующих из желудочков, имеют эпикардиальное происхождение.

Анализ количественной ПЦР РНК, выделенной из этих первичных культур эпикардиальных клеток, также показывает устойчивую экспрессию эпикардиально-специфических генов с очень низкой экспрессией генов маркеров кардиомиоцитов. В данном случае локализация ZO-1 в плазматической мембране указывает на то, что клеткам еще предстоит пройти эпителиально-мезенхимальный переход. Кроме того, иммуноокрашивание на альфа-тубулин демонстрирует поляризованное выравнивание микротрубочек эпикардиальных клеток, способствуя направленной миграции клеток во время их перехода.

После шести дней культивирования и дифференцировочной среды присутствие гладкомышечного актина свидетельствует об успешной дифференцировке эпикардиальных клеток в гладкомышечные клетки. Действительно, иммуноокрашивание фаллоидином в анализе инвазии коллагенового геля показывает способность клеток, полученных из эпикарда, к миграции. Чтобы определить глубину проникновения клеток в коллагеновый матрикс, можно создать 3D-реконструкцию на основе конфокальных изображений для визуализации z-стека проникновения клеток, полученных из эпикарда.

При заборе желудочков очень важно не повредить эпикард. После этой процедуры могут быть применены другие методы оценки дифференцировки, миграции и экспрессии белков клеточной поверхности эпикардиальных клеток, чтобы ответить на дополнительные вопросы об их функции. Этот метод может помочь исследователям в области кардиологии изучить биологию эпикарда с использованием мышиных моделей.