Изоляция, культуры и трансдукция взрослых мышей кардиомиоцитов

Этот протокол описывает пошаговый метод воспроизводимой изоляции и долгосрочного культивирования кардиомиоцитов взрослых мышей с высокой продуктивностью, чистотой и жизнеспособностью.

Общая цель этой процедуры заключается в выделении жизнеспособных первичных кардиомиоцитов взрослых мышей для посева и трансдукции аденовирусного вектора. Этот метод позволит ответить на некоторые ключевые вопросы в области сердечно-сосудистых исследований. В частности, мы можем скорректировать, что препятствует вступлению и завершению клеточного цикла кардиомиоцитов взрослых млекопитающих.

Основное преимущество этого метода заключается в том, что можно получить высокий выход жизнеспособных кардиомиоцитов взрослых мышей для долгосрочного культивирования. Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, так как процедуры экстракции сердца и канюляции сложны, но должны быть выполнены быстро и эффективно. Чтобы извлечь сердце, начните с лечения взрослой мыши пятью международными единицами гепарина на грамм массы тела путем внутрибрюшинной инъекции.

Подождите 20 минут, чтобы гепарин успел циркулировать в сердце. Затем, после введения анестезии, подтвердите отсутствие реакции на защемление пальцев ног и роговичные рефлексы и прикрепите конечности животного к операционной платформе. Простерилизуйте область разреза, обильно нанеся 70 процентов этинола, а затем промокните волосы насухо лабораторной салфеткой.

Затем с помощью щипцов подтяните кожу чуть ниже грудины и сделайте боковой разрез через кожу и брюшину. Затем, используя гемостатики, осторожно поднимите грудную клетку через грудину и с помощью небольших ножниц для рассечения удлините разрез в форме буквы V по направлению к осевому направлению. Прорежьте первое ребро и проколите диафрагму с каждой стороны, удерживая грудную клетку приподнятой с помощью гемостатика.

С помощью маленьких ножниц Iris полностью пересекте диафрагму. Затем с помощью гемостатиков втяните грудную клетку рострально и быстро, но осторожно продлите разрез через грудную клетку к осевому направлению с обеих сторон. Полностью втяните средний отдел грудной клетки, положив прикрепленные гемостатики для удержания ткани на месте, и удалите перикард с помощью тонких щипцов.

Далее с помощью изогнутых щипцов мягко приподнять сердце и пересечь прикрепленные вены и артерии. Промойте сердце в ледяном перфузионном буфере, затем переложите сердце на небольшой кусочек сетки размером 215 микрон. Добавьте ледяной буфер для перфузии для замедления сокращений миокарда и поместите чашку под микроскоп для вскрытия.

С помощью ножниц с тонкой радужной оболочкой обрежьте любые доступные несердечные ткани. Затем пересеките аорту возле брахиоцефальной артерии, следя за тем, чтобы пузырьки или остатки тканей не попали в отверстие. Чтобы канюлировать сердце, заполните чашку Петри ледяным перфузионным буфером до тех пор, пока раствор не поднимется над отверстием канюли 18 калибра.

Затем, удерживая кончик канюли и аорты ниже поверхности буфера, приложите аорту к канюле до тех пор, пока кончик иглы не окажется дистальнее аортального клапана. Проведите предварительно завязанный шелковый шов 7-0 вниз по стержню иглы канюляции, пока шов не окажется чуть выше кончика иглы, и затяните узел тонкими щипцами. Наложите второй шов чуть выше первого.

Затем медленно надавите на шприц до тех пор, пока через коронарную сосудистую сеть не будет введено 0,5 миллилитра перфузионного буфера. После извлечения шприца подсоедините канюлю к выходному отверстию перфузии. В конце перфузии с помощью щипцов удалите сердце из канюли и поместите сердце в пустую чашку Петри.

С помощью тонких ножниц радужной оболочки быстро обрежьте внежелудочковую ткань и промойте желудочки в новой чашке Петри, содержащей перфузионный буфер. После промывания переложите желудочки в сухую чашку Петри и поместите в стерильный колпак. Соберите 7,5 миллилитров буфера для пищеварения из тепловой рубашки перфузионной системы, и добавьте 2,8 микролитра одного моляра хлорида кальция.

Перемешайте раствор методом инверсии. А затем добавьте два-три миллилитра хлорида кальция, дополненного буфером для пищеварения, в желудочки. С помощью тонких щипцов быстро тритхелит ткань желудочка до тех пор, пока большинство кусочков не станет меньше одного кубического миллиметра, и добавьте оставшийся буфер для пищеварения, дополненный хлоридом кальция, к диссоциированным тканям.

Перемешайте фрагменты путем легкого перемешивания. И инкубируйте их при температуре 37 градусов Цельсия и пятипроцентном углекислом газе с непрерывным перемешиванием каждые две минуты до тех пор, пока не будет высвобождено достаточное количество кардиомиоцитов. Затем верните чашку в колпак для ламинарного потока и с помощью пипетки для переноса аккуратно диссоциируйте ткань еще больше.

Надев стерильные перчатки, сложите сетку 215 микрон в конус и держите ее над конической трубкой объемом 50 миллилитров. Нанесите тканевую кашицу на сетку пипеткой и дайте фильтрату стечь в пробирку. Затем следует промывка с 7,5 миллилитрами предварительно подогретого стоп-буфера.

Перелейте клеточную суспензию в коническую форму объемом 15 миллилитров и дайте клеткам осесть под действием силы тяжести в течение 15 минут. Затем с помощью новой пипетки для переноса осторожно удалите надосадочную жидкость, пока над клетками не останется только от 50 до 100 микролитров раствора. Добавьте к клеткам 10 миллилитров предварительно подогретой уравновешенной питательной среды, и перемешайте путем мягкой инверсии.

Наконец, после еще одной 15-минутной инкубации при комнатной температуре используйте новую переносную пипетку, чтобы удалить надосадочную жидкость из отстоявшихся клеток, пока не останется только от 50 до 100 микролитров среды. Сразу после выделения кардиомиоциты сохраняют преимущественно палочковидный вид с интактными саркомерами и острой наружной мембраной при ярком освещении. Иммуноокрашивание на кардиомиоцитарно-специфические саркомерные маркеры, такие как альфа-актинин, выявляет отчетливый паттерн саркомерных полос.

После нескольких дней в культуре кардиомиоциты приобретают округлую морфологию. В течение одной-двух недель живые кардиомиоциты прикрепляются к субстрату и начинают распространяться. Трансдукция аденовирусом, наблюдаемая в этих GFP-положительных кардиомиоцитах, может быть использована для достижения сильной экспрессии генов в течение 48-72 часов.

После освоения этой техники ее можно выполнить за четыре часа, если она выполнена правильно. При попытке проведения этой процедуры важно помнить о том, что необходимо обеспечить безопасную канюляцию, свободную от пузырьков воздуха, чтобы эффективно профункционировать коронарную сосудистую систему. После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как иммуноокрашивание или визуализация в реальном времени, чтобы ответить на такие вопросы, как почему кардиомиоциты взрослых млекопитающих устойчивы к делению клеток?

Не забывайте, что работа с аденовирусом может быть чрезвычайно опасной, поэтому необходимо соблюдать соответствующие меры предосторожности, например, работать в боксе биобезопасности второго класса.