Выделение мышиной эмбриональных кроветворных эндотелиальных клеток

Общая цель этой процедуры заключается в выделении первичных гемогенных эндотелиальных клеток из эмбриональных тканей мышей с помощью сортировки клеток, активируемых флуоресценцией. Основное преимущество этой методики заключается в том, что она позволяет надежно и специфично выделять жизнеспособные гемогенные эндотелиальные клетки из эмбриональных кроветворных тканей. Эти клетки затем могут быть использованы для последующего анализа и культивирования.

Гемогенные эндотелиальные клетки, а также гемопоэтические стволовые клетки и клетки-предшественники, которые могут быть выделены с помощью этого метода, затем будут использованы для ответа на ключевые вопросы о регуляции их развития и функции. Как правило, у людей, плохо знакомых с этим методом, могут возникнуть трудности с идентификацией побочной популяции клеток, которая включает в себя гемогенные эндотелиальные клетки, а также гемопоэтические стволовые клетки и клетки-предшественники. Процедуры диссекции эмбриональной ткани и сканирования будут продемонстрированы Кэт Марсело, бывшей аспиранткой моей лаборатории.

А также Эмили Гритс, нынешний научный сотрудник по клиническим исследованиям. И Джен Фанг, действующий постдок. Начните с протирания всех рабочих поверхностей 70% этанолом и положите абсорбент под прокладку на поверхность лабораторного стола.

Далее положите усыпленный стебель лежа на спине и обильно опрыскайте нижнюю часть живота 70%-ным этанолом. Сделайте длинный горизонтальный разрез перпендикулярно средней линии нижней брюшной стенки. Затем следуют два дополнительных горизонтальных разреза в один дюйм, идущие вверх и вниз от середины горизонтального разреза.

Затем рассеките брюшную стенку, чтобы полностью обнажить правый и левый рога матки, содержащие несколько вынашиваемых эмбрионов. С помощью щипцов захватите один из двух маточных рогов и с помощью ножниц и щипцов отделите матку от окружающего миометрия. И перенесите оба рога в стерильную 60-миллиметровую пластину для культуры тканей из полистирола на льду.

Поместите пластину под стандартный световой препарирующий микроскоп и с помощью щипцов отделите каждую плацентарную единицу плода. Для каждой единицы рассеките мышечный слой каждого маточного мешка, обнажив лежащий под ним гестационный мешок и децидуа. Чтобы изолировать желточный мешок, аккуратно удалите как можно большую часть мешочка из заключенного в него эмбриона.

Удаление остатков ткани желтого мешка из эмбриона собственно в эмбриональном зарождении вителлиновых сосудов, по мере необходимости. Чтобы изолировать аорту-гонад-мезонефрос или AGM, пересеките эмбрион ниже сердца и передних конечностей и отбросьте грудную клетку и область головы. Затем пересеките эмбрион чуть ниже задних конечностей, удалите и выбросьте ткань хвоста.

Затем удалите задние конечности и избыток брюшной ткани из оставшегося участка, содержащего AGM. По мере сбора каждого желточного мешка или AGM соберите эмбриональные ткани в HPSS + в пробирках объемом 1,5 миллилитра на льду. Чтобы получить одноклеточную суспензию, центрифугируйте эмбриональную ткань и повторно суспендируйте тканевую гранулу в одном миллилитре коллагеназы второго типа, разведенной в HPSS+Инкубируйте пробирку в течение 30 минут на водяной бане при температуре 37 градусов Цельсия.

Перемешивание методом инверсии каждые пять минут. В конце инкубации пропустите образец 10 раз через пипетку P1000, чтобы аккуратно механически диссоциировать ткань. Затем снова поверните образец, повторно суспензив гранулу в одном миллилитре ледяного HPSS+Now отфильтруйте образец через сетчатое фильтр для клеток 70 микрон и подсчитайте ячейки.

После подсчета снова собирают клетки методом центрифугирования. И повторно суспендируйте гранулу при 37 градусах Цельсия DMN+, в соотношении от 10 до 10 до шестой клетки на миллилитр. Чтобы пометить клетки для FAC-сортировки, необходимо распределить не менее 100 микролитров клеток в пробирки объемом 1,5 миллилитра и добавить в пробирку Hoechst Only и контрольную пробирку с верапамилом до конечной концентрации 50 микрометров.

Поместите все пробирки при температуре 37 градусов Цельсия на пять минут. Затем добавьте пробирки hoechst only и hoechst plus verapamil only, а также пробирку с образцом до конечной концентрации пять микрограммов на миллилитр и верните пробирки до 37 градусов Цельсия на один час в защищенном от света месте, аккуратно перемешивая пробирки путем инверсии каждые 15 минут. В конце инкубации центрифугируйте все образцы и разбавьте гранулы до концентрации от одного до 10 до пятых клеток на миллилитр в холодном HPSS+теперь добавьте флуоресцентно конъюгированные антитела в соответствующие контрольные пробирки только для антител, а также в пробирку с образцами до конечной концентрации два микрограмма на миллилитр для 30-минутной инкубации на льду, защищенном от света.

В конце инкубации раскрутите образцы и повторно суспендируйте гранулы в 500 микролитрах ледяного HPSS. Процедите образцы через сетчатые фильтрующие колпачки пятимиллилитровых полистирольных трубок с круглым дном и поместите пробирки на лед, защищенный от света. Затем сразу же анализируют клетки с помощью проточной цитометрии.

Следуя стандартной дискриминации живых ячеек и дублетов по прямой и боковой стороне рассеяния, события популяции визуализируются на линейной диаграмме красных и синих точек Хёхста в виде плеча, смещенного влево от небоковых событий популяции. Эта популяция побочных эффектов значительно уменьшается при лечении верапамилом. Клетки, не относящиеся к боковой популяции, идентифицируются как плотный кластер клеток, примыкающий к популяции боковой популяции.

Фракция непобочных популяционных клеток содержит негемогенные эндотелиальные клетки, которые далее выделяются как CD31+CD45-события. Для идентификации гемопоэтических стволовых и прогениторных клеток и гемогенных эндотелиальных клеток из боковой популяционной фракции выбираются дочерние ворота, выявляющие CD45+ и CD45-клетки. Гемогенные эндотелиальные клетки впоследствии идентифицируются из CD45-клеток на дифференциальном графике cKit против дочернего графика Flk1 как двойные положительные события.

Гемопоэтические стволовые и прогениторные клетки идентифицируются из фракции CD45+ на отдельном дочернем участке как Flk1-cKit+клетки. После этой процедуры можно настроить культуры на основе метилцеллюлозы для функциональной оценки гемопоэтической способности выделенных клеток, или же клетки могут быть немедленно обработаны для анализа экспрессии генов и белков. Как только вы освоите эту технику, ее можно освоить примерно за четыре-пять часов, если она будет выполнена правильно.

При попытке выполнить эту процедуру важно помнить о том, что образцы должны быть защищены от света и льда, если не указано иное, чтобы максимизировать жизнеспособность клетки. Этот метод позволил исследователям в области гемотососудистой биологии изучить гемогенную спецификацию эндотелиальных клеток и их продукцию гемопоэтических стволовых и прогениторных клеток во время эмбрионального развития. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как выделить гемогенные эндотелиальные клетки из эмбриональных тканей мышей с помощью проточной цитометрии.

Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.