Анализы для деградации неправильно свернутых белков в клетках

В этом отчете описываются протоколы измерения скорости деградации неправильно свернутых белков с помощью вестерн-блоттинга или флуоресцентных анализов. Эти методы могут быть применены для анализа других неправильно свернутых белков и для высокопроизводительного скрининга.

Общая цель этого анализа заключается в измерении скорости клеточной деградации неправильно свернутых белков. Неправильно свернутые белки связаны со многими нейродегенеративными заболеваниями. Этот анализ помогает исследовать клеточные системы контроля качества белков, которые являются защитниками от аберрантных белков.

Белки, склонные к неправильному сворачиванию, могут существовать в клетках в различных формах. Сочетая фракционирование клеток с методом циклогексана, основное преимущество этого метода заключается в том, что он позволяет точно измерить период полураспада неправильно свернутых веществ. В качестве примера мы используем два модельных белка.

Высокоагрегационный полиглутаматный белок, Atxn1 82Q и конформационно нестабильный ядерный мутант люциферазы. Протокол также может быть применен к другим измерениям неправильно свернутых белков. Чтобы провести анализ деградации Atxn1 82Q GFP, поместите приблизительно 3x10^5 клеток HeLa в 35-миллиметровые планшеты со средой DMEM и 10% FBS.

Инкубируйте клетки в течение ночи так, чтобы они достигли конфлюенции от 40 до 60% к моменту трансфекции. Через четыре-пять часов после трансфекции клеток Atxn1 82Q GFP PRK5 под флуоресцентным микроскопом используйте волну возбуждения от 450 до 490 нанометров для изучения живых клеток на экспрессию GFP в ядрах, характеризующихся наличием как диффузных, так и небольших пятен сигналов GFP. Непосредственно перед обработкой циклогексимидом соберите одну пластину клеток, удалив среду и используя три миллилитра ледяного PBS для двойной промывки клеток.

Затем заморозьте тарелку на сухом льду. Для остальных пластин клеток удалите среду методом вакуумной аспирации и добавьте два миллилитра свежего DMEM, содержащего 50 микрограмм на миллилитр циклогексимида. Также добавьте 10 микромолей ингибитора протеасом, MG132 на одну пластину.

Инкубируйте обработанные клетки в течение четырех, восьми, 12 и 16 часов перед замораживанием на сухом льду. После сбора обработанных MG132 клеток в течение 16 часов соскребите замороженные клетки со всех планшетов в 150 микролитров буфера для лизиса ледяных клеток и инкубируйте на льду в течение 30 минут. Центрифугируйте лизаты в настольной центрифуге при 17 000x g и четырех градусах Цельсия в течение 15 минут.

Затем перенесите надосадочную жидкость, содержащую растворимые белки MP40, в другую пробирку. Промойте гранулы, аккуратно добавив примерно 200 микролитров 1x PBS в пробирки, не повреждая гранулы. Осторожно извлеките PBS с помощью аспирации или пипетки, повторно суспендируйте гранулы в 150 микролитрах ледяного буфера для гранул, а затем инкубируйте их на льду в течение 15-30 минут.

Затем добавьте 75 микролитров 3x кипящего буфера в растворимые фракции MP40 и нерастворимые фракции MP40, ресуспендированные из гранул. Затем нагрейте образцы при температуре 95 градусов Цельсия на термоблоке в течение пяти минут. Добавьте загрузочный буфер для геля SDS в аликвоту из уваренных растворимых и нерастворимых фракций MP40.

Загрузите равные объемы образцов, собранных из всех временных точек, в гель SDS-PAGE. Определение растворимого MP40 и растворимого SDS Atxn1 82Q GFP методом вестерн-блоттинга с использованием антител против GFP и усиленной хемилюминесценции. Для исследования устойчивого SDS Atxn1 82Q из гранулированной фракции с помощью фильтрационного анализа методом замедления установки установили аппарат с точечной диаграммой, удерживающий мембрану из ацетата целлюлозы толщиной 0,2 мкм.

Затем загрузите от 80 до 120 микролитров кипяченых нерастворимых образцов MP40 в каждую лунку аппарата для блот-блоттинга. После фильтрации образцов через мембрану с помощью вакуума обнаружите агрегаты Atxn1 82Q GFP, застрявшие на мембране, с помощью иммуноблоттинга против GFP. Крайне важно использовать анализ замедления фильтра для изучения уровней устойчивой формы SDS с течением времени.

Это связано с тем, что растворимая форма SDS может трансформироваться в устойчивую к SDS форму, а не разлагаться. В этом примере устойчивая к SDS форма минимальна и остается на том же уровне, что и в эксперименте с погоней. Для проведения анализа деградации после ночной трансфекции клеток HeLa NLS-люциферазой-GFP необходимо исследовать живые клетки под инвертированным флуоресцентным микроскопом на предмет экспрессии GFP с длиной волны возбуждения от 450 до 490 нанометров.

Непосредственно перед обработкой циклогексимидом соберите одну пластину клеток, удалив среду, и используйте три миллилитра ледяного PBS для двойной промывки клеток. Затем заморозьте тарелку на сухом льду. Для остальных пластин, после удаления среды, добавьте два миллилитра свежего DMEM, содержащего 50 микрограмм на миллилитр циклогексимида и добавьте 10 микромолей ингибитора протеасом MG132 на одну пластину.

Обрабатывайте клетки в течение 1,5, трех, 4,5 и шести часов до сбора, как только что описано, собирая обработанные MG132 клетки через шесть часов. После сбора последней временной точки клеток соскребите каждую пластину в 150 микролитров ледяного буфера для лизиса клеток и инкубируйте на льду в течение 30 минут. Инкубируйте образцы на тепловом блоке при температуре 95 градусов Цельсия в течение пяти минут, перед тем как провести SDS-PAGE и вестерн-блоттинг в соответствии с текстовым протоколом.

Добавьте загрузочный буфер для геля SDS в лизаты цельных клеток для получения конечной концентрации 2% SDS и 50 миллимолярных DTT. После посева и трансфекции клеток HeLa в 96 луночных планшетах в соответствии с текстовым протоколом, через 20-24 часа после трансфекции, исследуйте клетки на экспрессию GFP. Удалите среду, добавьте примерно 200 микролитров 1x PBS в каждую лунку, а затем аспирируйте ее, чтобы удалить остатки DMEM.

Добавьте 60 микролитров низкофлуоресцентного DMEM с 5% FBS и 50 микрограммов на миллилитр циклогексимида и добавьте 10 микромоляров MG132 к одному набору образцов. С помощью считывателя флуоресцентных пластин измерьте сигнал GFP, считывая показания с пластин каждый час в течение восьми-10 часов. Экспортируйте данные и проведите статистический анализ в соответствии с текстовым протоколом.

При анализе в стационарном состоянии микроскопически видимые ядерные агрегаты Atxn1 82Q GFP могут наблюдаться в 30-50% клеток HeLa через 20 часов после трансфекции. Как видно из вестерн-блоттинга, период полувыведения Atxn1 82Q GFP в растворимой фракции SDS составляет около пяти часов. В отличие от незначительного снижения или отсутствия Atxn1 82Q GFP в растворимой фракции MP40 в течение 16 часов.

Деградация Atxn1 82Q GFP частично ингибируется обработкой клеток MG132. Эти изображения показывают, что через 20 часов после трансфекции мутантные агрегаты GFP NLS-люциферазы DM становятся микроскопически видимыми в 5-15% клеток HeLa. Вестерн-блоттинг показал, что период полувыведения растворимой в SDS NLS-люциферазы DM мутантной GFP составляет от двух до трех часов.

Кроме того, интенсивность цветения трансфицированных клеток также уменьшается со временем при лечении циклогексимидом. Примерно через шесть часов после обработки циклогексимидом растворимая NLS-люцифераза DM мутантная GFP в значительной степени разлагается, что позволяет предположить, что оставшаяся флуоресценция генерируется агрегированными веществами, устойчивыми к деградации. Эти изображения флуоресценции подтверждают, что агрегированный, но не диффундирующий GFP остается в клетках через девять часов после лечения циклогексимидом.

Что ж, анализ на основе иммуноблоттинга занимает несколько дней. Скорость деградации белка может быть получена сразу после погони за циклогексимидом с использованием флуоресцентного анализа. Как иммуноблоттинг, так и флуоресцентные анализы могут быть применены к исследованиям других неправильно свернутых белков.

Последний также подходит для высокопроизводительного скрининга для идентификации макромолекул или небольших соединений, которые могут модулировать деградацию неправильно свернутых белков. Важно помнить, что для некоторых неправильно свернутых белков, таких как Atxn1 82Q, период полураспада может быть измерен только с помощью фракционирования клеток и иммуноблоттинга, и это связано с тем, что неправильно свернутые формы, которые быстро разлагаются, составляют лишь небольшую часть общей экспрессии Atxn1 82Q. Чтобы раскрыть механизм контроля качества белка, анализы деградации белка должны сочетаться с анализом уровней устойчивого состояния агрегатов, а также того, что они являются перегородками в различных клеточных фракциях.

Также могут быть проведены другие эксперименты, такие как анализ сворачивания белка in vitro и агрегации. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как измерять скорость деградации неправильно сворачивающихся белков с помощью различных стратегий. Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.