Высокая-контент In Vitro Панкреатическими островками β-клеток репликации Discovery Platform

Критические проблемы для области исследования диабета должны понять молекулярные механизмы, которые регулируют репликацию β-клеток островков и разработать методы стимуляции регенерации β-клеток. При этом метод высокого содержания скрининга для выявления и оценки репликации способствующего активности β-клеток малых молекул представлена.

Общая цель этой платформы для скрининга репликации бета-клеток с высоким содержанием состоит в том, чтобы облегчить исследование молекулярных путей, ограничивающих рост бета-клеток. Этот метод может помочь ответить на важные вопросы в области биологии бета-клеток. Например, одна из ключевых сигнальных молекул и путей, которые контролируют регенерацию бета-клеток.

Основные преимущества данной методики заключаются в том, что она позволяет увеличить пропускную способность клеточной выстилки до конкретной оценки и автоматизированного анализа данных репликации первичной островковой клетки. Использование этой техники имеет потенциал для развития регенеративной терапии диабета. Болезнь с серьезными медицинскими и экономическими издержками для нашего общества.

Начните с использования 10-миллилитрового шприца с желудочным раствором, оснащенного иглой 22 калибра, для химуляции общего желчного протока в месте соединения кистозного и общего печеночных протоков или дистальнее него. Поддерживая общий желчный проток рукояткой скальпеля, медленно вводите 10 миллилитров раствора. После того, как вся коллагеназа была введена, с помощью изогнутых щипцов и ножниц отделяют раздутую поджелудочную железу от нисходящей ободочной кишки, кишечника, желудка и сплайна.

Затем поместите до двух панкреатов в 50-миллилитровую трубку на лед, содержащую пять миллилитров раствора для пищеварения поджелудочной железы. Когда все панкреаты будут собраны, поместите пищеварительные трубки в водяную баню с температурой 37 градусов Цельсия на 15 минут с легким вращением каждые три минуты. По окончании варки энергично встряхните трубочки по вертикали 10 раз.

И добавьте к экземплярам 10 миллилитров буферов для холодной стирки. Энергично встряхните трубки еще пять раз и положите их на лед. Далее наполните трубки до конечного объема 50 миллилитров буфером для холодной промывки и переверните трубки пять раз.

Затем закрутите ткани вниз и слейте надосадочную жидкость, стараясь не выбить гранулы. Повторно суспендируйте тканевую суспензию в 25 миллилитрах буфера для промывки с последующим легким вортексом. Повторите шаги вращения и повторного суспензирования еще два раза.

Тканевые суспензии переливают через тканевое сито 30 меш в стерильный стакан объемом 250 миллилитров. Промойте пищеварительные трубки с дополнительными 20 миллилитрами буфера для промывки и вылейте промывочные трубки на сетку, чтобы удалить непереваренные ткани поджелудочной железы и жировые ткани. Разделите отфильтрованный материал между двумя новыми 50-миллилитровыми пробирками и гранулируйте ткань центрифугированием.

Затем сцедите надосадочную жидкость и переверните трубки, чтобы слить лишний буфер. Чтобы очистить островки, добавьте 20 миллилитров градиента холодной плотности в гранулы ткани поджелудочной железы и аккуратно пипетируйте вверх и вниз пять раз, чтобы равномерно повторно суспендировать содержимое. Затем медленно нанесите 10 миллилитров HBSS на стенку каждой пробирки градиента, стараясь сохранить острую жидкую границу раздела и разделить клетки поджелудочной железы путем центрифугирования.

Используйте пипетку объемом 10 миллилитров для переноса островкового слоя с границы раздела в новые конические пробирки объемом 50 миллилитров. Затем промойте островки в 40-50 миллилитрах промывочного буфера три раза. Переворачивая свои трубки, чтобы повторно суспендировать гранулы между каждым центрифугированием.

После окончательной промывки занесите пробирки в капюшон для культуры тканей. Аспирируйте надосадочную жидкость. И повторно суспендируйте гранулы в шести миллилитрах островковой среды.

Просейте островки из каждой пробирки в отдельные лунки из шести лунок для культивирования тканей. И закрутите тарелку, чтобы собрать островки в серединах колодцев. Оцените чистоту островков под микроскопом.

Для дальнейшей очистки островков собирают их с помощью пипетки объемом в один миллилитр и переносят в соседнюю лунку с использованием шести миллилитров островковой среды. Повторите закручивание островков, сбор, перенос и микроскопическую оценку до тех пор, пока чистота не превысит 90 процентов. Затем перенесите островки в одну 10-сантиметровую чашку для культуры тканей, содержащую 20 миллилитров островковой среды.

После того как все островки будут собраны, поместите чашку для культивирования в инкубатор для тканевых культур на ночь. Затем покройте лунки планшета на 384 лунки 40 микролитрами кондиционированной среды 804G на лунку и поместите планшет в инкубатор на ночь. На следующий день с помощью скребка для ячеек аккуратно отделите островки.

Затем переложите островки в трубку объемом 50 миллилитров. Соберите островки методом центрифугирования. Затем вымойте их с 20 миллилитрами теплого,б,с.

Центрифугируйте в течение одной минуты. Аспирируйте надосадочную жидкость. И повторно суспендируйте гранулу в ноль целых двух, пяти процентов трипсина.

Инкубируйте островки в течение 10 минут при температуре 37 градусов Цельсия, используя пипетку объемом в один миллилитр для аспирации и дозирования островков 10 раз через пять и 10 минут. После второго тритерации подсчитайте 20 микролитров образца трипсинизированных островковых клеток. Если ткани полностью переварены, приостановите диссоциативные островковые клетки в концентрации четыре целых пять умножить на десять до четырех клеток на миллилитр в среде с функцией островков.

Затем с помощью аспиратора с 12-луночным коллектором удалите среду состояния 804G из ранее подготовленной 384-луночной пластины. И просейте 70 микролитров островков на лунку в ряды от c до n в столбцах с четвертого по 21. Дайте островкам прилипнуть в инкубаторе для тканевых культур в течение 48 часов.

Через два дня с помощью 12-луночного аспиратора коллектора осторожно удалите островковую среду и с помощью 12-канальной пипетки добавьте 35 микролитров островковой среды в каждую лунку. Затем переложите по 35 микролитров из свежеприготовленных двух, х сложных растворов интересующего вас в каждую лунку. И вернуть островки в инкубатор еще на 48 часов.

Через 48 часов зафиксировать, окрасить и проанализировать обработанные соединением культуры островков с помощью автоматизированной платформы визуализации с высоким содержанием содержимого. В типичном эксперименте скорость репликации DAPI, PD-1 и инсулиноположительных бета-клеток определяется процентом бета-клеток, совместно экспрессирующих Ki-67. Репликация альфа-клеток измеряется как процент DAPI-положительных, PD-отрицательных, Glucagon положительных, Ki-67 коэкспрессирующих клеток.

Например, в этом репрезентативном эксперименте было замечено, что диприридамол способствует репликации бета-клеток, но не альфа-клеток. Эту методику можно выполнить за семь дней. После этой процедуры соединения, которые в репликации бета-клеток могут быть изучены в дальнейшем, чтобы выявить механизмы действия.

Этот метод позволил исследователям в области биологии бета-клеток выявить новые сигнальные факторы и пути, которые регулируют рост бета-клеток. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как проверить способность малых молекул избирательно стимулировать регенерацию бета-клеток.