Высокая-контент In Vitro Панкреатическими островками β-клеток репликации Discovery Platform
16 июля 2016 г.
Критические проблемы для области исследования диабета должны понять молекулярные механизмы, которые регулируют репликацию β-клеток островков и разработать методы стимуляции регенерации β-клеток. При этом метод высокого содержания скрининга для выявления и оценки репликации способствующего активности β-клеток малых молекул представлена.
Общая цель этой платформы для скрининга репликации бета-клеток с высоким содержанием состоит в том, чтобы облегчить исследование молекулярных путей, ограничивающих рост бета-клеток. Этот метод может помочь ответить на важные вопросы в области биологии бета-клеток. Например, одна из ключевых сигнальных молекул и путей, которые контролируют регенерацию бета-клеток.
Основные преимущества данной методики заключаются в том, что она позволяет увеличить пропускную способность клеточной выстилки до конкретной оценки и автоматизированного анализа данных репликации первичной островковой клетки. Использование этой техники имеет потенциал для развития регенеративной терапии диабета. Болезнь с серьезными медицинскими и экономическими издержками для нашего общества.
Начните с использования 10-миллилитрового шприца с желудочным раствором, оснащенного иглой 22 калибра, для химуляции общего желчного протока в месте соединения кистозного и общего печеночных протоков или дистальнее него. Поддерживая общий желчный проток рукояткой скальпеля, медленно вводите 10 миллилитров раствора. После того, как вся коллагеназа была введена, с помощью изогнутых щипцов и ножниц отделяют раздутую поджелудочную железу от нисходящей ободочной кишки, кишечника, желудка и сплайна.
Затем поместите до двух панкреатов в 50-миллилитровую трубку на лед, содержащую пять миллилитров раствора для пищеварения поджелудочной железы. Когда все панкреаты будут собраны, поместите пищеварительные трубки в водяную баню с температурой 37 градусов Цельсия на 15 минут с легким вращением каждые три минуты. По окончании варки энергично встряхните трубочки по вертикали 10 раз.
И добавьте к экземплярам 10 миллилитров буферов для холодной стирки. Энергично встряхните трубки еще пять раз и положите их на лед. Далее наполните трубки до конечного объема 50 миллилитров буфером для холодной промывки и переверните трубки пять раз.
Затем закрутите ткани вниз и слейте надосадочную жидкость, стараясь не выбить гранулы. Повторно суспендируйте тканевую суспензию в 25 миллилитрах буфера для промывки с последующим легким вортексом. Повторите шаги вращения и повторного суспензирования еще два раза.
Тканевые суспензии переливают через тканевое сито 30 меш в стерильный стакан объемом 250 миллилитров. Промойте пищеварительные трубки с дополнительными 20 миллилитрами буфера для промывки и вылейте промывочные трубки на сетку, чтобы удалить непереваренные ткани поджелудочной железы и жировые ткани. Разделите отфильтрованный материал между двумя новыми 50-миллилитровыми пробирками и гранулируйте ткань центрифугированием.
Затем сцедите надосадочную жидкость и переверните трубки, чтобы слить лишний буфер. Чтобы очистить островки, добавьте 20 миллилитров градиента холодной плотности в гранулы ткани поджелудочной железы и аккуратно пипетируйте вверх и вниз пять раз, чтобы равномерно повторно суспендировать содержимое. Затем медленно нанесите 10 миллилитров HBSS на стенку каждой пробирки градиента, стараясь сохранить острую жидкую границу раздела и разделить клетки поджелудочной железы путем центрифугирования.
Используйте пипетку объемом 10 миллилитров для переноса островкового слоя с границы раздела в новые конические пробирки объемом 50 миллилитров. Затем промойте островки в 40-50 миллилитрах промывочного буфера три раза. Переворачивая свои трубки, чтобы повторно суспендировать гранулы между каждым центрифугированием.
После окончательной промывки занесите пробирки в капюшон для культуры тканей. Аспирируйте надосадочную жидкость. И повторно суспендируйте гранулы в шести миллилитрах островковой среды.
Просейте островки из каждой пробирки в отдельные лунки из шести лунок для культивирования тканей. И закрутите тарелку, чтобы собрать островки в серединах колодцев. Оцените чистоту островков под микроскопом.
Для дальнейшей очистки островков собирают их с помощью пипетки объемом в один миллилитр и переносят в соседнюю лунку с использованием шести миллилитров островковой среды. Повторите закручивание островков, сбор, перенос и микроскопическую оценку до тех пор, пока чистота не превысит 90 процентов. Затем перенесите островки в одну 10-сантиметровую чашку для культуры тканей, содержащую 20 миллилитров островковой среды.
После того как все островки будут собраны, поместите чашку для культивирования в инкубатор для тканевых культур на ночь. Затем покройте лунки планшета на 384 лунки 40 микролитрами кондиционированной среды 804G на лунку и поместите планшет в инкубатор на ночь. На следующий день с помощью скребка для ячеек аккуратно отделите островки.
Затем переложите островки в трубку объемом 50 миллилитров. Соберите островки методом центрифугирования. Затем вымойте их с 20 миллилитрами теплого,б,с.
Центрифугируйте в течение одной минуты. Аспирируйте надосадочную жидкость. И повторно суспендируйте гранулу в ноль целых двух, пяти процентов трипсина.
Инкубируйте островки в течение 10 минут при температуре 37 градусов Цельсия, используя пипетку объемом в один миллилитр для аспирации и дозирования островков 10 раз через пять и 10 минут. После второго тритерации подсчитайте 20 микролитров образца трипсинизированных островковых клеток. Если ткани полностью переварены, приостановите диссоциативные островковые клетки в концентрации четыре целых пять умножить на десять до четырех клеток на миллилитр в среде с функцией островков.
Затем с помощью аспиратора с 12-луночным коллектором удалите среду состояния 804G из ранее подготовленной 384-луночной пластины. И просейте 70 микролитров островков на лунку в ряды от c до n в столбцах с четвертого по 21. Дайте островкам прилипнуть в инкубаторе для тканевых культур в течение 48 часов.
Через два дня с помощью 12-луночного аспиратора коллектора осторожно удалите островковую среду и с помощью 12-канальной пипетки добавьте 35 микролитров островковой среды в каждую лунку. Затем переложите по 35 микролитров из свежеприготовленных двух, х сложных растворов интересующего вас в каждую лунку. И вернуть островки в инкубатор еще на 48 часов.
Через 48 часов зафиксировать, окрасить и проанализировать обработанные соединением культуры островков с помощью автоматизированной платформы визуализации с высоким содержанием содержимого. В типичном эксперименте скорость репликации DAPI, PD-1 и инсулиноположительных бета-клеток определяется процентом бета-клеток, совместно экспрессирующих Ki-67. Репликация альфа-клеток измеряется как процент DAPI-положительных, PD-отрицательных, Glucagon положительных, Ki-67 коэкспрессирующих клеток.
Например, в этом репрезентативном эксперименте было замечено, что диприридамол способствует репликации бета-клеток, но не альфа-клеток. Эту методику можно выполнить за семь дней. После этой процедуры соединения, которые в репликации бета-клеток могут быть изучены в дальнейшем, чтобы выявить механизмы действия.
Этот метод позволил исследователям в области биологии бета-клеток выявить новые сигнальные факторы и пути, которые регулируют рост бета-клеток. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как проверить способность малых молекул избирательно стимулировать регенерацию бета-клеток.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данной статье представлен метод высокопроизводительного скрининга, направленный на поиск малых молекул, стимулирующих репликацию β-клеток. Этот метод позволяет решить критические задачи в исследовании диабета, в частности, в понимании молекулярных механизмов, регулирующих рост β-клеток.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Исследования диабета
- Клеточная биология
- Регенерация β-клеток
Теоретическая справка
- Понимание механизмов репликации β-клеток имеет решающее значение для лечения диабета.
- Современные методы стимуляции регенерации β-клеток ограничены.
- Высокопроизводительный скрининг с анализом содержания (high-content screening) может ускорить поиск молекул, стимулирующих репликацию.
- Диабет создает серьезные проблемы для здравоохранения и экономики.
Цель исследования
- Изучить молекулярные пути, ограничивающие рост β-клеток.
- Разработать платформу для высокопроизводительного скрининга малых молекул.
- Способствовать исследованиям в области биологии β-клеток и регенеративной терапии.
Используемые методы
- Платформа высокопроизводительного скрининга для репликации β-клеток.
- Автоматизированный анализ данных репликации первичных клеток островков.
- Оценка малых молекул на предмет их способности стимулировать репликацию.
- Повышенная пропускная способность для проведения специфических оценок.
Основные результаты
- Идентификация малых молекул, стимулирующих репликацию β-клеток.
- Представление о ключевых сигнальных путях, участвующих в регенерации β-клеток.
- Демонстрация эффективности платформы в высокопроизводительном скрининге.
- Потенциальное применение для разработки методов регенеративной терапии диабета.
Выводы
- Метод высокопродуктивного скрининга является ценным инструментом для исследования диабета.
- Понимание биологии β-клеток может привести к разработке новых терапевтических стратегий.
- Дальнейшее изучение идентифицированных молекул может способствовать регенерации β-клеток.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Исследования диабета на этапе поиска новых лекарственных средств требуют надежных платформ для идентификации модуляторов репликации β-клеток панкреатических островков, что является ключевым сдерживающим фактором в разработке регенеративной терапии. Данная платформа высококонтентного скрининга на основе изображений использует первичные клетки островков для обеспечения максимальной биологической релевантности и прогностической достоверности при первичном отборе соединений. Автоматизация и количественные результаты данной платформы напрямую поддерживают принятие решений по формированию портфеля препаратов на этапе перехода от валидации мишеней к идентификации ведущих соединений.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишеней
- Позволяет исследовать молекулярные пути, ограничивающие рост β-клеток, с использованием физиологически релевантных первичных клеток.
- Поддерживает функциональную валидацию мишеней путем дифференциации специфических для данной клеточной линии и общих митогенных эффектов.
- Облегчает прогностическую оценку рисков за счет сохранения ограничений роста in vivo, которые отсутствуют в иммортализованных линиях.
Скрининг и разработка анализа
- Обеспечивает стандартизированную, автоматизированную и количественную оценку репликации β-клеток в формате 384 лунок.
- Снижает влияние субъективного фактора экспериментатора и повышает воспроизводимость за счет оптимизированного иммуноокрашивания и автоматизированного анализа данных.
- Позволяет подготовить валидированные системы из первичных клеток для надежной последующей оценки соединений и проведения механистических исследований.
Трансляционные и доклинические исследования
- Соответствует биологическим особенностям заболевания за счет моделирования эндогенных ограничений регенерации β-клеток.
- Обеспечивает преемственность от этапа открытия до доклинической валидации, поддерживая адаптацию к исследованиям островков человека.
- Предоставляет данные о механизмах работы митогенных путей для принятия обоснованных решений о продвижении проекта с учетом рисков.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Эта платформа связывает этапы раннего поиска и идентификации ведущих соединений, обеспечивая высокосодержащий количественный скрининг малых молекул в первичных клетках островков, результаты которого пригодны для последующих трансляционных исследований.
- Поисковая биология: Поддерживает проверку гипотез о регуляции роста β-клеток и картирование сигнальных путей.
- Скрининг: Обеспечивает воспроизводимые, масштабируемые и количественные показатели для сортировки соединений.
- Аналитика: Обеспечивает автоматизированное измерение скорости репликации β-клеток и специфичности линий.
- Трансляционные исследования: Способствует адаптации метода для использования с островками человека для обеспечения преклинической преемственности.
- Корпоративное повторное использование: Создает возможность многократного использования высококонтентного скрининга для портфелей исследований по биологии β-клеток.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышает достоверность прогнозов и снижает механистическую неопределенность при валидации мишеней в β-клетках.
- Операционная ценность: Стандартизирует рабочие процессы, повышает воспроизводимость и обеспечивает умеренную масштабируемость при работе с первичными клетками.
- Стратегическая ценность: Улучшает процесс принятия решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go) и эффективность использования капитала за счет фокусирования на системах, релевантных заболеванию.
- Влияние на портфель: Поддерживает приоритизацию кандидатов для регенеративной терапии с учетом оценки рисков.
Особенности реализации
- Требуется опыт в области первичного выделения, культивирования и иммуноокрашивания островков.
- Необходим доступ к инфраструктуре для высокопроизводительного имиджинга и автоматизированного анализа данных.
- Требуется строгая стандартизация подготовки клеток и условий анализа между всеми рабочими группами.
- Адаптация метода для островков человека возможна, но может быть ограничена ресурсами и пропускной способностью.
- Ограничения включают нарушение архитектуры островков, а также компромисс между стоимостью и пропускной способностью, характерный для использования первичных клеток.
