Изучение роли альвеолярных макрофагах при раке молочной железы Метастазы

Здесь мы описываем модель и подход к изучению функций легочных альвеолярных макрофагов при метастазировании рака. Чтобы продемонстрировать роль этих клеток в метастазировании, была использована сингенная (4T1) модель рака молочной железы в сочетании с истощением альвеолярного макрофага клодронатными липосомами.

Общая цель этих экспериментов заключается в определении роли легочных альвеолярных макрофагов в метастазировании рака с использованием сингенной модели рака молочной железы. Этот метод может ответить на некоторые ключевые вопросы в области иммунологии опухолей и метастазирования рака, например, почему легкие являются одной из наиболее распространенных мишеней для метастазирования гепатогенного рака. Основное преимущество этого метода в том, что он использует очень хорошо зарекомендовавшую себя модель рака молочной железы с очень специфичным методом легочных альвеолярных микрофагов.

Демонстрировать эту процедуру будет Сурья Кумари Вадреву, научный сотрудник моей лаборатории. В день инъекции опухолевых клеток сначала положите бритую мышь под наркозом на хирургическую подушечку. Затем отаскайте один раз от 10 до пятой части опухолевых клеток в 100 микролитрах PBS в инсулиновый шприц с нулевым значением 5 целых 5 миллилитров, оснащенный иглой 29 калибра.

Затем большим и указательным пальцами приподнять кожу возле второго и третьего соска, и ввести иглу под кожу в жировую подушку молочной железы чуть ниже третьего соска. Медленно подкожно вводите клетки, чтобы образовался пузырь под кожей, и верните животное в клетку с наблюдением до полного выздоровления. Через четыре-пять дней после прививки, чтобы измерить опухоли, прощупайте место опухоли и используйте штангенциркуль, чтобы использовать как большие, так и наименьшие диаметры опухолей для определения объема опухоли.

Чтобы визуализировать введенные клетки 41GFP, поместите мышь под наркозом на подвижную сцену внутри тепловизора и визуализируйте место опухоли с помощью флуоресцентной микроскопии. В шкафу биобезопасности laminer airflow через шесть дней после введения опухолевых клеток сделайте вихревые линии липосом, чтобы равномерно распределить частицы, и аспирируйте 60 микролитров суспензии в стерильный наконечник для пипетки. Поместите кончик рядом с ноздрей животного, находящегося под наркозом, и медленно выпустите пять микролитров раствора липосомы, позволяя мыши вдохнуть каплю.

Крайне важно вводить раствор липосома медленно, сохраняя при этом надлежащий уровень анестезии, чтобы животное могло регулярно дышать во время родов. Когда все 60 микролитров будут введены, дайте мышке полностью восстановиться, и верните животное в клетку. Чтобы подсчитать и оценить метастазы на поверхности легких, поместите легкие под диссекционный микроскоп и сфокусируйте объектив до тех пор, пока не будет получен четкий обзор поверхности легких.

Затем вручную подсчитайте метрические показатели на передней и задней сторонах обоих легких и визуализируйте опухоли с помощью флуоресцентной микроскопии. После подсчета и визуализации метастазов с помощью хирургических ножниц и щипцов измельчите легкое и перенесите кусочки ткани в 15-миллилитровую коническую трубку, содержащую три миллилитра буфера для пищеварения. Краситель протестирует фрагменты на вращающемся шейкере в инкубаторе при температуре 37 градусов Цельсия в течение 40 минут, а затем тритерирует суспензию для диссоциации ткани.

Затем отфильтруйте тканевую суспензию через ситечко толщиной 40 микрон, чтобы удалить любые комки, при необходимости продавливая более крупные кусочки через ситечко с помощью поршня шприца. Когда получена суспензия одиночных клеток, соберите клетки центрифугированием и лизируйте эритроциты с помощью буфера ACK в течение 10 минут при комнатной температуре. Затем промойте гранулу два раза в восьми миллилитрах RPMI.

После второго центрифугирования мы суспензируем клетки в трех миллилитрах полной среды RPMI для подсчета и снова раскручиваем клетки. Теперь разбавьте ячейки в соотношении от 10 до 10 мк на 100 микролитров буферной концентрации FAX и перенесите 100 микролитров элекций клеток в отдельные лунки V-образного дна, 96-луночный планшет. Соберите ячейки на дне лунок с помощью центрифугирования, затем переверните пластину, чтобы дать буферу стечь.

Заблокируйте клетки 100 микролитрами CD16 Блокируйте CD32 FC на 15 минут при четырех градусах Цельсия, и снова центрируйте пластину. Затем переверните пластину, чтобы удалить надосадочную жидкость, как только что было показано, и добавьте интересующий коктейль антител в соответствующие лунки. Через 30 минут при четырех градусах Цельсия гранулируйте клетки центрифугированием с последующей промывкой 200 микролитрами буфера FAX.

Затем повторно суспендируйте гранулы в 200 микролитрах свежего PBS и окрасьте образцы красителем на 20 минут при температуре четыре градуса Цельсия. В конце инкубации промойте клетки еще в 200 микролитрах PBS, и зафиксируйте образцы в 100 микролитрах одного процента параформальдегида для хранения при четырех градусах Цельсия. Непосредственно перед их анализом переносим клеточные суспензии в полипропиленовые пробирки проточной цитометрии.

Инъекция опухолевых клеток 4T1GFP в жировую подушку молочной железы приводит к образованию опухолей у мышей, которые повторяют метастатическое распространение рака молочной железы человека, о чем свидетельствуют быстро формирующиеся метастазы, наблюдаемые в легких. Стабильная трансфекция клеток 4T1 с помощью GFP облегчает отслеживание метастазирующих опухолевых клеток и количественную оценку метастатической нагрузки. Рутинная хастология в сочетании с алгоритмами цифровой патологии также является хорошим инструментом для количественной оценки и верификации метастазов.

Кроме того, многоцветный проточный циметрический анализ позволяет охарактеризовать даже редкие клеточные популяции, такие как CD11b отрицательные, CD11c F80 положительные альвеолярные макрофаги. Истощение биклотрената может быть подтверждено отсутствием этих CD11c F480-положительных клеток в диссоциированных легких животных, получавших липосомы. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как вводить опухолевые клетки в жировую подушку молочной железы, следить за ростом опухоли и метастазированием, истощением альвеолярных макрофагов, а также подготавливать клетки легких к проточному цикометрическому анализу.