Получение и определение характеристик липофильных доксорубицина мицеллах пролекарством

Протокол для подготовки и определения характеристик липофильный доксорубицина пролекарства загружен 1,2-distearoyl- зп глицеро-3-phosphoethanolamine- N - [амино (полиэтиленгликоль) -2000] (DSPE-PEG) мицеллы описывается.

Общая цель данного протокола заключается в описании процедур получения и определения характеристик липофильного доксорубицина, наполненного пролекарственными препаратами мицелла. Этот метод обеспечивает простой и надежный подход к разработке мицелла. Синтез липофильного пролекарства доксорубицина может повысить лекарственную нагрузку и стабильность, тем самым решая значительную проблему в разработке рецептуры мицелла.

Препарат мицелла может усилить нацеливание лекарств на опухоли и, следовательно, снизить токсичность лечения рака. В дополнение к применению, описанному в данном проекте, эта технология также может быть использована для приготовления нанолекарств для агентов. Для синтеза липофильного доксорубицина пролекарством DOX-PA взвесьте 390 миллиграммов доксорубицина и 243 миллиграмм гидрозида пальмитиновой кислоты и переложите их в круглую донную колбу.

Добавьте в колбу 150 миллилитров безводного метанола с помощью стеклянного шприца. Затем добавьте 39 микролитров трифторуксусной кислоты, или ТЖК, с помощью пипетки. С помощью магнитной мешалки перемешайте реакционную смесь в течение 18 часов при комнатной температуре в темноте.

Для очистки DOX-PA с помощью силикагелевой колонки сначала удаляют растворитель в реакционной смеси с помощью ротационного испарителя. Добавьте три грамма силикагеля после того, как объем смеси уменьшится примерно до 20 миллилитров. Продолжайте ротационное выпаривание, чтобы получить сухие порошки и обеспечить впитывание продуктов на силикагель.

Подержите образец под вакуумом еще 30 минут после образования сухих порошков. Упакуйте 50 грамм силикагеля в колонку, используя дихлорметан в качестве растворителя. Осторожно добавьте в колонку образец силикагеля, содержащий абсорбированный продукт.

Разбавляйте колонку смесью дихлорметана и метанола при постепенном увеличении процентного содержания метанола, тем самым увеличивая полярность растворителя. Собирайте фракции эллюента в пробирках по 25 миллилитров на пробирку и контролируйте прогресс с помощью тонкослойной хроматографии, или ТСХ. Соедините все фракции, содержащие чистый DOX-PA, и удалите растворитель с помощью ротационного испарителя до образования сухого порошка.

Далее просушите изделие под вакуумом в течение ночи. Чтобы приготовить мицеллы, растворите 40 миллиграммов DSPE-PEG и четыре миллиграмм DOX-PA с двумя миллилитрами метанола в стеклянном флаконе объемом 10 миллилитров. Удалите органический растворитель под вакуумом с помощью ротационного испарителя, пока во флаконе не не образуется тонкая пленка.

Затем перелейте два миллилитра фосфатно-солевого буфера Дульбекко с pH 7,4 в стеклянный флакон. Выберите ультразвуковую ванну, которая может генерировать достаточную ультразвуковую мощность для диспергирования тонкой полимерной пленки лекарства. Выходная мощность ультразвуковой ванны, используемой в данном протоколе, составляет 110 Вт.

Поместите флакон в ультразвуковую ванну на три минуты при комнатной температуре для образования мицелл. Храните мицеллы при температуре четыре градуса Цельсия при кратковременном хранении и минус 20 градусов Цельсия при длительном хранении. После того, как мицеллы приготовлены, выполните различные характеристики для определения концентрации препарата в мицеллах, размеров частиц и противоопухолевой активности in vitro.

Чтобы определить концентрацию DOX-PA и эффективность инкапсуляции препарата, разбавьте 25 микролитров мицелл, загруженных лекарственным средством, с 500 микролитрами ДМСО. Измерьте поглощение на глубине 490 нанометров с помощью УФ-ВИД спектрометра и рассчитайте концентрацию препарата и эффективность инкапсуляции, как описано в текстовом протоколе. Чтобы оценить противоопухолевую активность in vitro, добавьте разведенные клеточные суспензии в 96-луночный планшет для культивирования клеток по 100 микролитров на лунку.

Инкубируйте клетки в инкубаторе для клеточных культур в течение 18 часов, чтобы обеспечить прикрепление клеток. Затем разбавляют раствор DOX DMSO и раствор DOX-PA DMSO средой для культивирования клеток для получения конечных концентраций препарата. Поддерживайте концентрацию ДМСО во всех образцах на уровне 0,5%, затем разбавляйте мицеллы DOX-PA средой для клеточных культур для получения окончательных концентраций препарата.

В качестве контроля используйте пустую среду для культивирования клеток. Извлеките из инкубатора 96 луночный планшет для культивирования клеток и замените среду для культивирования клеток 100 микролитрами среды, содержащей различные лечебные средства. Инкубируйте клетки в инкубаторе для клеточных культур еще 72 часа.

Далее отсасывайте среду и добавляйте 100 микролитров среды, содержащей 0,5 миллиграмм на миллилитр МТТ. Инкубируйте клетки в инкубаторе для клеточных культур еще два часа. Осторожно удалите среду и добавьте 100 микролитров ДМСО для растворения кристаллов формазана.

Измерьте поглощение с помощью микропланшетного спектрофотометра на длине волны 570 нанометров и опорной длине волны 670 нанометров. Наконец, рассчитайте жизнеспособность клеток, как описано в текстовом протоколе. Схема синтеза DOX-PA приведена здесь.

Пальмитиновая кислота конъюгируется с доксорубицином через чувствительный к pH гидрозинлинкер. Структура DOX-PA была дополнительно подтверждена с помощью протонного ЯМР-спектра. Наблюдаются характерные пики ЯМР как от доксорубицина, так и от пальмитиновой кислоты.

Буквы обозначают пики и соответствующие им фрагменты внутри структуры. Пустые мицеллы DSPE-PEG без лекарства выглядят как прозрачная жидкость, в то время как мицеллы DOX-PA DSPE-PEG выглядят как красная жидкость, что обусловлено содержанием DOX-PA в мицеллах. Средний размер частиц для пустых мицелл DSPE-PEG составляет около 17,0 нанометров.

Загрузка DOX-PA немного увеличила размер частиц мицелла, при этом средний размер частиц для мицелл DOX-PA DSPE-PEG составил около 25,7 нанометров. Зависящее от концентрации снижение жизнеспособности клеток было достигнуто путем обработки клеток DU145 свободными доксорубицинами, свободными мицеллами DOX-PA или DOX-PA. Хотя свободный доксорубицин более эффективен, чем свободные мицеллы DOX-PA или DOX-PA при более низких концентрациях, группы DOX-PA показали большее снижение жизнеспособности клеток, чем свободный доксорубицин при более высоких концентрациях.

Кроме того, по-видимому, нет существенной разницы между мицеллами DOX-PA и DOX-PA как при высоких, так и при более низких концентрациях. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как готовить составы мицелла методом пленочной дисперсии. Важно помнить, что описанный метод может быть использован для получения мицелла с различными препаратами и материалами-носителями.

Конструкция материала-носителя имеет решающее значение для улучшения характеристик рецептуры. После этой процедуры препарат мицелла может быть дополнительно оценен in vivo с использованием моделей опухолей животных для проверки противоопухолевой активности.