Спирального ганглия Нейрон эксплант и электрофизиологии на многопроцессорных электродных Массивы

Общая цель этой процедуры — продемонстрировать, как культивировать и регистрировать электрофизиологическую активность слуховых нейронов на многоэлектродных решетках. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области исследований слуха, такие как характеристика электрофизиологических свойств слуховых нейронов и стимуляция электродных областей. Основное преимущество этой методики заключается в том, что она позволяет проводить внеклеточную неинвазивную одновременную регистрацию нейронной активности большого количества слуховых нейронов.

Последствия этой техники распространяются и на терапию. Фактически, они могут быть использованы для реализации электронного интерфейса ваших протезов, таких как кохлеарный имплантат, для восстановления слуха у глухих пациентов. Чтобы начать эту процедуру, приготовьте раствор для покрытия ECM, сначала разморозив смесь ECM на льду.

Затем разведите смесь ECM в основной питательной среде в соотношении один к 10, и храните ее на льду. Для новых МЭА в колпаке с ламинарным потоком погрузите их в 70% этанол на 30 секунд. Впоследствии промойте их дистиллированной водой в течение 30 секунд.

Затем дайте MEA высохнуть в течение 30 минут. Чтобы покрыть MEA, нанесите 50 микролитров раствора покрытия на MEA холодным наконечником для пипетки объемом 200 микролитров. Затем дайте MEA постоять от 30 минут до одного часа при комнатной температуре.

После этого удалите раствор для покрытия. Добавьте 100 микролитров питательной среды с добавлением 10% FBS и пять нанограммов на миллилитр BDNF и оставьте при комнатной температуре до покрытия ткани. Затем поместите чашку Петри, содержащую покрытые покрытием MEA, в большую чашку Петри и добавьте маленькую чашку Петри, содержащую PBS для увлажнения.

Во время этой процедуры стерилизуйте голову щенка с помощью 70% этанола. Затем разрежьте соединение между кожей и черепом по сагиттальной линии. Далее разрежьте череп сагито и удалите мозг.

После этого вырежьте височные кости из черепа и поместите их в чашку Петри, содержащую стерильный ледяной HBSS. Под диссекционным микроскопом рассеките барабанную перепонку с помощью пары тонких щипцов и изолируйте внутреннее ухо. Затем удалите косточку улитки.

Затем удалите спиральную связку и SV вместе, удерживая базальную часть спирального ганглия и SV щипцами и медленно разматывая SV от основания к вершине. Отделите орган Корти от спирального ганглия в модиолусе, удерживая базальную часть спирального ганглия и орган Корти щипцами и медленно раскручивая орган Корти от основания к вершине. Затем вырежьте боковые экспланты из спирального ганглия с помощью щипцов или ножниц или ножей для тонкой микродиссекции.

Теперь перенесите спиральный ганглий экспланты и орган Corti на MEA. Затем поместите экспланты SG над областью электродов и органом Corti на расстоянии примерно пяти миллиметров от области электрода. Поместите экспланты и орган Corti на MEA, избегая повреждения тканей.

После этого осторожно поместите МЭА в инкубатор и культивируйте при температуре 37 градусов Цельсия и 5% CO2. На следующий день визуально осмотрите экспланты на предмет их прикрепления к МПС. Затем добавляйте 100 микролитров питательной среды, содержащей 10% FBS и BDNF, ежедневно в течение пяти дней подряд.

На шестой день добавьте два миллилитра питательной среды, содержащей 10% FBS и пять нанограммов на миллилитр BDNF, и культивируйте ткань в течение еще 13 дней. После коллективного 18-дневного культивирования промойте культуру МЭА приготовленным ранее внеклеточным раствором комнатной температуры. Затем высушите контакты микросхемы MEA с помощью куска ткани и установите MEA на держатель MEA.

Наконец, установите MEA в систему записи. После этого добавьте 300 микролитров внеклеточного раствора и подождите 10 минут, чтобы система стабилизировалась перед записью. Теперь запишите спонтанную активность в течение двух минут со всех электродов и определите активные электроды.

Затем определите электроды, реагирующие на стимуляцию. Чтобы исключить артефакт стимуляции, стимулируйте от одного и того же электрода 10 раз. Если культура реагирует по крайней мере в восьми из 10 раз, можно предположить, что это положительный ответ на стимуляцию, вызванную электродами.

Чтобы выявить фоновый шум, нанесите на культуру ТТХ в концентрации одного микромоля для блокировки напряжения натриевых каналов и затем запишите его в течение двух минут. Вот следы оригинальных записей шести из 63 электродов, которые показывают спонтанную активность, а это растровый график шести электродов после обнаружения спайков. Каждая полоса представляет один потенциал действия.

Этот растровый график включает в себя все активные электроды. Активность записывается с 63 электродов в течение двух минут. На этом рисунке показано, что для стимуляции культуры с одного электрода использовался двухфазный стимул общей продолжительностью 80 микросекунд и амплитудой 80 микроампер.

Этот репрезентативный пример кривых исходных данных показывает потенциалы действия, и все это без ответов после стимуляции. А вот культура спирального ганглия на MEA, иммуноокрашенная на нейронный маркер, TUJ, в конце эксперимента для визуализации нейронного покрытия области электрода. Электрод, используемый для стимуляции, обозначен зеленым цветом, а ответные электроды — красным

После освоения этой техники ее можно выполнить за 50 минут, если она выполнена правильно. Хотя эти методы могут дать представление об электрофизиологии спиральных ганглиозных нейронов, они также могут быть применены к другим системам, таким как культуры головного или спинного мозга. После разработки эта методика открывает путь для исследователей в области материаловедения и нанотехнологий, быстрой блоттинговой модификации поверхности электродов нейронной записи и стимуляции.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как культивировать и регистрировать электрофизиологическую активность, располагая эксплант нейронов на многоэлектродных массивах.