Капиллярный электрофорез Контролировать Peptide прививкой на хитозана пленок в режиме реального времени

Общая цель этого метода капиллярного электрофореза заключается в мониторинге реакции прививки пептидов на пленки хитозана в режиме реального времени. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области аналитической химии и химии полимеров, например, как протекает реакция и насколько эффективен процесс прививки. Основное преимущество этой методики заключается в том, что не требуется подготовка образцов, а реакционную смесь можно анализировать в режиме реального времени.

Несмотря на то, что этот метод может дать представление о процессах реакции, он также может быть применен к таким системам, как связывание противоракового препарата с носителем лекарства или переваривание риса или сухих завтраков. Взвесьте два грамма ледяной уксусной кислоты и смешайте до 100 миллилитров с ультрачистой водой. Добавьте 100 миллилитров 2%-ного массового процента водного раствора уксусной кислоты в 1,7 грамма порошка хитозана.

Перемешивайте в течение пяти дней с помощью мешалки и магнитной мешалки при комнатной температуре, накрытой алюминиевой фольгой, или в темноте. Центрифугируйте дисперсию хитозана при 1,076 g при 23 градусах Цельсия в течение одного часа. После центрифугирования соберите надосадочную жидкость с помощью шприца и выбросьте осадок.

На каждую пленку нанесите 10 миллилитров суспензии хитозана в девятисантиметровую пластиковую чашку Петри при комнатной температуре. Оставьте накрытые пленки сохнуть не менее чем на семь дней. С помощью ножниц разрежьте сухие пленки на квадраты по одному сантиметру.

На этом этапе эксперимент можно поставить на паузу. Промойте 10 квадратных пленок хитозана в пяти миллилитрах PBS в течение двух часов в чашке Петри при комнатной температуре. В течение этого времени подготовьте и проверьте инструмент для капиллярного электрофореза.

Приготовьте 43,5-сантиметровый капилляр из плавленого кремнезема с внутренним диаметром 50 микрометров, ослабив полимерное наружное покрытие капилляра на заданную длину тупой посудой, а затем защелкнув капилляр. Создайте окно для капилляра, с помощью зажигалки прожгите полимерное покрытие на расстоянии 8,5 сантиметров от входного отверстия. После того как капилляр остынет, протрите его этанолом.

Затем прожгите зажигалкой покрытие капилляра с каждого конца на несколько миллиметров. После остывания протрите его этанолом во второй раз. Поместите капилляр внутрь окна обнаружения и установите его в капиллярную кассету, поместив его на одинаковой длине на входе и выходе и намотав его на шпиндели кассеты.

Затем установите кассету в инструмент для капиллярного электрофореза. Задайте параметры метода для каждого разделения. В меню программного обеспечения выберите пункт Метод, а затем Редактировать весь метод.

Выберите вкладку CE, чтобы изменить условия CE. Установите температуру, время, напряжение и флаконы, используемые для разделения. В разделе Предварительное кондиционирование задайте последовательные промывки.

Используйте 10 минут с одним молярным гидроксидом натрия, пять минут с 0,1 молярного гидроксида натрия, пять минут с ультрачистой водой и пять минут с 75 миллимолярным буфером бората натрия при pH 9,2 для первого метода в последовательности. Проверьте другие методы в последовательности, следуя той же процедуре. Для последующих методов установите последовательные промывки в разделе предварительного кондиционирования как одна минута с одним молярным гидроксидом натрия и пять минут с 75 миллимолярным буфером бората натрия при pH 9,2.

В разделе Впрыск задайте параметры для гидродинамического впрыска с давлением 30 миллибар в течение 10 секунд для всех методов. В разделе Separation (Разделение) установите условия разделения на 30 киловольт и 25 градусов Цельсия в течение девяти минут для всех методов. Впрыскивание и отделение нейтрального внутреннего стандарта.

Для нейтрального внутреннего стандарта используйте 10 микролитров 10% объемного ДМСО в воде, разбавленной до 450 микролитров 75 миллимолярного буфера бората натрия. Перед началом последовательности убедитесь, что в параметрах последовательности установлены правильные папки и номер файла. Затем нажмите Последовательность, чтобы начать эксперимент.

Разделение стандартов позволяет провести валидацию прибора перед проведением эксперимента. Это необходимо для успешного проведения эксперимента. Затем введите и отделите стандарт олигоакрилата таким же образом, чтобы проверить валидность капилляра.

Приостановите последовательность до тех пор, пока реакция прививки не будет готова к началу. Чтобы выполнить прививку RGDS на хитозановую пленку, сначала взвесьте пептид и связующие агенты. Через два часа после начала замачивания пленки хитозана в PBS, растворите пептид и связующие агенты в пяти миллилитрах PBS.

Возьмите 50 микролитров аликвоты этого раствора и добавьте два микролитра 10% объема к объему ДМСО в воду в качестве внутреннего нейтрального стандарта. Проанализируйте аликвоту с помощью капиллярного электрофореза, используя те же условия анализа, что и раньше. Далее снимите с чашки Петри ПБС, используемую для промывки пленок хитозана.

Добавьте пятимиллилитровый раствор пептида и связующих агентов в чашку Петри, содержащую пленки хитозана. Накройте чашку Петри парафиновой пленкой и поместите ее на орбитальный шейкер при комнатной температуре. Возьмите 50 микролитров аликвот реакционной среды в установленное время.

Аликвоты, взятые из реакционной среды, необходимо немедленно проанализировать. Соответствующие шаги должны быть предприняты в быстрой последовательности, чтобы обеспечить анализ в режиме реального времени. Добавьте два микролитра 10% объема к объему ДМСО в воду в качестве внутреннего нейтрального стандарта для каждой аликвоты.

Анализируйте аликвоты с помощью капиллярного электрофореза сразу после их взятия. По завершении разделения промойте капилляры ультрачистой водой в течение 10 минут. После четырех часов встряхивания и снятия аликвоты выньте чашку Петри из шейкера.

После удаления реакционной среды из чашки Петри добавьте пять миллилитров PBS для промывки пленок хитозана. Снимите PBS с чашки Петри, промойте пленки хитозана ультрачистой водой и дайте им высохнуть в течение ночи. Храните пленки при температуре минус 20 градусов Цельсия в пластиковой чашке Петри.

Репрезентативные результаты первой аликвоты химической реакции показывают разделение различных химических реагентов. Пик пептида RGDS в это время является отправной точкой реакции и может быть использован для количественной оценки эффективности прививки. Поскольку реакция прививки постоянно контролируется, площадь пика RGDS продолжает уменьшаться до тех пор, пока не останется постоянной, что означает окончание эксперимента.

Второй пик справа от пика EDC HCl появляется, как и ожидалось, когда реакция протекает дальше. Интегрирование пика RGDS во времени позволяет рассчитать потребление пептида. ЯМР-спектроскопия в набухшем состоянии пленок хитозана в PBS позволяет обнаружить прививку RGDS, пленки хитозана и пленки хитозана, привитой пептидом RGDS, или набухшей в PBS.

Звездочка обозначает сигналы, присвоенные РГДС. После освоения этой техники ее можно выполнить за шесть часов, если она выполнена правильно. Пытаясь выполнить эту процедуру, важно помнить о том, что все растворы должны быть приготовлены заранее.

После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как твердотельная спектроскопия на животных, чтобы ответить на дополнительные вопросы, такие как прямая проверка экспериментов по построению графиков. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как использовать свободный раствор капиллярного электрофореза при мониторинге химических реакций.