Острый сетчатке Модель для оценки крови сетчатке Барьерные нарушения и потенциальных лекарственных препаратов для лечения

Недорогой, простой в использовании и мощная система создана для оценки потенциальных методов лечения, которые могли бы улучшить барьерную сетчатки крови нарушение, вызванное гистамином. Утечка кровеносного сосуда, активация клеток Мюллера и непрерывность нейронных процессов используются для оценки реакции ущерба и его разворот с потенциальным препаратом, lipoxin А4.

Общая цель этой модели сетчатки ex vivo заключается в скрининге лекарств, которые улучшают нарушение нейронного барьера крови. Этот метод может ответить на несколько ключевых вопросов в области нервных дегенеративных заболеваний, например, каковы ранние события и как мы можем провести скрининг лекарств, которые могут помочь в лечении этих пациентов. Основное преимущество этой техники заключается в том, что она недорогая, простая в использовании, быстрая и адаптируемая.

Как правило, новички в этом методе будут испытывать трудности, потому что получение надежных и воспроизводимых данных зависит от технических навыков для создания хороших образцов. В первую очередь здесь используется сетчатка свиньи, полученная из коммерческого источника. После получения из источника, глазные яблоки необходимо держать при температуре четыре градуса, или на льду, и обрабатывать как можно скорее.

Начните диссекцию в капюшоне для культуры тканей с разреза вокруг хрусталика, чтобы открыть глазную крышку. Затем с помощью щетки аккуратно удалите стекловидное тело, не натягивая сетчатку. С помощью щетки аккуратно отсоедините сетчатку от разреза, чтобы обнажить диск зрительного нерва.

Перережьте зрительный нерв бритвой и освободите сетчатку. Перенесите сетчатку в чашку Петри и тщательно промойте сетчатку один раз с помощью холодного HBSS. Поместите образец в HBSS на лед.

Далее с помощью бритвы разрежьте сетчатку пополам симметрично. Когда требуется лечение, обрабатывается одна половина сетчатки, в то время как другая половина той же сетчатки должна быть обработана, чтобы установить базовую линию и скорректировать вариации животных. Аккуратно переложите образцы в шестилуночный планшет, содержащий три миллилитра стабилизационной среды на лунку.

Уравновесьте сетчатку в течение 30 минут при температуре 37 градусов Цельсия в инкубаторе с атмосферой, содержащей 5% углекислого газа. После инкубации тщательно отаскайте стабилизирующую среду, и добавьте в каждую лунку по три миллилитра среды, содержащей гистамин и LXA4. Инкубируйте образцы еще час.

После полоскания теплым стерильным PBS добавьте в каждую лунку по три миллилитра 4%-ной PFA и выдержите 15 минут при комнатной температуре. По истечении времени инкубации быстро аспирируйте PFA и промойте образцы с помощью PBS. Добавьте в лунки 10% сахарозы и выдерживайте от двух до четырех часов при четырех градусах Цельсия.

Затем замените 10% сахарозу на 30% сахарозу и выдерживайте в течение ночи при четырех градусах Цельсия. Затем смешайте одну часть коммерческого средства для замораживания с двумя частями 20% сахарозы, чтобы получилась рабочая среда для замораживания. Оставьте при температуре четыре градуса Цельсия на ночь или дольше, пока пузырьки воздуха не исчезнут.

На следующий день замените 30%-ную сахарозу рабочей средой для замораживания и дайте ей сбалансироваться в течение пяти минут при комнатной температуре. После уравновешивания обрежьте каждую сетчатку на прямоугольники размером три на пять миллиметров, затем заморозьте срезы сетчатки, поместив их в замораживающую среду, содержащуюся в цилиндре из алюминиевой фольги. Убедитесь, что срезы сетчатки расположены вертикально, чтобы обеспечить поперечное сечение сетчатки после разреза, и заморозьте их в жидком азоте.

Разрежьте каждый блок на криостате на срезы по 14 микрон и закрепите секции на стеклянных предметных стеклах. Храните предметные стекла при температуре минус 80 градусов Цельсия до использования. Начните иммуноокрашивание с промывания участков 5% сахарозофосфатным буфером, или SPB.

Затем заблокируйте неспецифические участки связывания, инкубируя секции и блокируя буфер на один час при комнатной температуре. Далее инкубируйте срезы с соответствующим первичным антителом в течение одного часа. По истечении часа отсадите раствор и трижды промойте срезы в 5% SPB.

Затем инкубируйте срезы с соответствующими вторичными антителами в течение одного часа, будучи защищенными от света. После трехкратной промывки срезов 5%-ным SPB подготовьте образцы к микроскопии, поместив их в среду, содержащую DAPI, и накрыв покровными стеклами. Наконец, сделайте снимки с помощью конфокального микроскопа.

Чтобы измерить ширину процесса, используйте увеличительное стекло, чтобы выбрать область участка, где происходят процессы, например, внешний ядерный слой. Затем выберите оптическое поле, где такие процессы видны и непрерывны. Нажмите на инструмент анализа в главном меню, а затем нажмите «Установить масштаб» в подменю, чтобы установить масштабную линейку в соответствии с микроскопическими настройками.

Выберите функцию линии в главном меню и проведите линию поперек процесса. Нажмите кнопку «Анализ» в главном меню, а затем нажмите «Измерить» в подменю, чтобы выполнить измерение. Чтобы проанализировать непрерывность процесса, вернитесь в главное меню и с помощью функции полигона выберите внутренний слой оргстекла в качестве интересующей области.

Измерьте площадь, нажав кнопку «Анализ», а затем «Измерить». Нажмите кнопку Процесс, Фильтр, а затем Варианты, чтобы улучшить края изображения, заменив каждый пиксель вариантом соседства. Затем автоматически настройте контрастность и яркость нажатием на изображение, настройте яркость и контрастность, а затем авто в подменю.

Затем посчитайте линии. На этих изображениях иммунореактивность IGG видна красным цветом. В контрольных группах IGG ограничен в кровеносных сосудах.

В гистаминовой группе IGG обнаруживается вне кровеносных сосудов, где он образует облака утечки, обозначенные пунктирными кругами. В группах, получавших лечение LXA4, IGG снова ограничен в кровеносных сосудах. Дальнейшее добавление LXA4 спасает функцию сосудов, индуцированную гистамином.

Эта гистограмма показывает процент негерметичных кровеносных сосудов в испытуемых группах. На этих изображениях представлено иммуноокрашивание на GFAP, которым окрашиваются клетки Мюллера. Положительное окрашивание достигается в отростках клеток Мюллера, по всей сетчатке и вокруг кровеносных сосудов.

Представлена ширина отростков ячейки Мюллера, из всех групп. Обработка гистамином или только LXA4 снижает ширину процесса. Но когда оба реагента были применены вместе, ширина процесса была сохранена.

На этих изображениях представлено иммуноокрашивание на MAP2. Наблюдается положительное окрашивание со стороны отростков и клеточных тел ганглиозных клеток. Представлена плотность непрерывных MAP2-положительных процессов ганглиозных клеток из всех групп.

Лечение гистамином снижает непрерывность дендритных процессов, в то время как LXA4 не оказывает существенных эффектов. После освоения этот эксперимент может быть проведен за три-пять дней, если он выполнен правильно, с пятью минутами на каждую сетчатку для вскрытия, шестью минутами для лечения, с последующим срезом, иммуноокрашиванием и анализом. При попытке этой процедуры важно использовать свежую ткань и надлежащий контроль.

После этой процедуры могут быть добавлены другие методы, такие как визуализация в реальном времени, для отслеживания изменений уровней кальция и митохондриальных свойств в режиме реального времени. После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как использовать эту модель острой культуры сетчатки ex vivo для создания дисфункции BRB, оценки повреждений и скрининга потенциальных лекарств. Спасибо вам большое за просмотр и всего наилучшего в ваших экспериментах.