Синтез и характеристика аспирином-фумарата пролекарственного соединения, которое угнетает NFκB активность и рак молочной железы стволовых клеток

Общие цели этой процедуры заключаются в том, чтобы продемонстрировать, как синтезируется противовоспалительный пролекарство аспирин-фумарат GTCpFE и как оно улучшает активность анти-NFkappaB и противораковых стволовых клеток в клетках рака молочной железы. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области терапии рака, показав, как мы можем перепрофилировать или даже улучшить противовоспалительные препараты для таргетной терапии резистентных стволовых клеток рака молочной железы. Основное преимущество этой методики заключается в том, что мы используем мультидисциплинарный подход для получения и характеристики улучшенного пролекарства аспирин-фумарат.

Продемонстрировать синтез пролекарства аспирин-фумарат GTCpFE будет Лорухама Дельгадо-Ривера, аспирант лаборатории доктора Грегори Тэтчера. В свою очередь, анти-NFkappaB активность GTCpFE в клетках рака молочной железы будет продемонстрирована Герганой Георгиевой, студенткой-исследователем фармацевтического факультета в лаборатории доктора Джонны Фрейзор. С помощью пластикового шприца с поршенем отмерьте 0,81 миллилитра метанола и смешайте его с 10 миллилитрами воды в колбе с круглым дном.

Остудите полученную смесь до нуля градусов Цельсия, поместив колбу на ледяную водяную баню. Добавьте в реакционную смесь 2,48 миллиграмм 4-гидроксибензилового спирта. Перемешивайте, пока раствор не станет прозрачным.

Далее готовят раствор О-ацетилсалициллоилхлорида в безводном толуоле, растворяя растворенное вещество в растворителе в отдельной колбе. С помощью пластикового шприца с плунжером добавьте этот раствор в смесь 4-гидроксибензилового спирта и оставьте реакцию помешивая при нуле градусов Цельсия. Контролируйте реакцию с помощью тонкослойной хроматографии, или ТСХ, как описано в текстовом протоколе.

Когда реакция завершится, снимите ледяную водяную баню и дайте реакции помешаться при комнатной температуре в течение 20 часов. Отфильтруйте осадок с помощью воронки Бюхнера с фриттированным диском средней пористости. Затем поместите твердое вещество в сцинтилляционный флакон и оставьте соединение в вакууме на ночь в эксикаторе при комнатной температуре.

Далее тщательно высушенную круглодонную колбу заклеиваем перегородкой и прокалываем ее иглой, которая подключена к системе вакуумного насоса. Надуйте воздушный шар с помощью газообразного аргона и соедините его с пластиковым шприцем с помощью иглы. Вставьте иглу, соединенную с аргоновым баллоном, через перегородку, герметизирующую круглодонную колбу, и снимите иглу, подключенную к вакуумному насосу.

Затем добавьте в отдельную колбу 4-гидроксиметилфениловый эфир, 2-ацетилоксибензойную кислоту, 4-диметиламинопиридин и триметиламин. Растворите химические вещества в пяти миллилитрах безводного тетрагидрофурана. С помощью пластикового шприца, прикрепленного к игле, добавьте раствор в герметичную круглодонную колбу.

Охладите смесь до нуля градусов по Цельсию, поместив колбу на ледяную водяную баню. К предыдущей смеси добавьте раствор этилфумароила хлорида и безводного тетрагидрофурана по каплям в течение 10 минут. Помешивайте полученную смесь в течение двух-четырех часов, наблюдая за реакцией ТСХ, как описано в протоколе.

Извлеките реакционную смесь, добавив ее в разделительную воронку вместе со 100 миллилитрами этилацетата и 50 миллилитрами рассола. Закройте воронку крышкой и энергично встряхните ее. Наклонив воронку в сторону от крышки, медленно откройте клапан, чтобы дать возможность воздуху выйти.

Как только экстракция будет завершена, удалите водную фазу и повторите экстракцию еще два раза. После удаления водной фазы высушите смесь, добавив сульфат натрия в органическую фазу до тех пор, пока твердое вещество не слипнется при перемешивании стеклянной посуды. С помощью другой воронки Бюхнера с фриттированным диском отфильтровать смесь в колбу с круглым дном, чтобы удалить сульфат натрия.

Затем выпарите до полного высыпания с помощью роторного испарителя с температурой, установленной на уровне 40 градусов по Цельсию. Далее подготовьте колонку с силикагелем и соответствующей фазой растворителя. После добавления соединения добавьте слой сульфата натрия для защиты колонки при добавлении растворителя.

По мере выполнения столбца отслеживайте элюат с помощью TLC. Наблюдайте за каждой второй пробиркой по мере их забора из колонки. Когда интересующий продукт разбавится, смешайте все образцы, содержащие чистый продукт, в большую колбу с круглым дном.

Высушите продукты с помощью ротационного испарителя с температурой ванны 40 градусов по Цельсию. Проведите культивирование клеток и трансфектируйте клетки ДНК для репортерного анализа люциферазного репортерного элемента NFkappaB, как описано в текстовом протоколе. Затем растворить исходные растворы ГТКФЭ или аспириновых препаратов в диметилсульфоксиде в 1000-кратной концентрации.

После 16 часов переливания по 1 мклитру транспортного средства или различного исходного раствора препарата в каждую лунку. После добавления препаратов инкубируйте клетки в течение двух часов при температуре 37 градусов Цельсия. Для активации пути NFkappaB в каждую лунку вводится провоспалительный цитокин, TNFalpha, в конечную концентрацию 10 нанограммов на миллилитр.

Также включите в себя только элемент управления TNFalpha. После инкубации клеток в течение четырех часов при температуре 37 градусов Цельсия отсасывайте среду. Храните клетки при температуре минус 80 градусов по Цельсию.

Измерьте люциферазу с помощью репортерной системы люциферазы в соответствии с инструкциями производителя. Для проведения маммосферного анализа сначала подготовьте маммосферную среду, как описано в текстовом протоколе. Далее подготавливают одиночные клетки клеточной линии MDA-MB-231 методом трипсинового расщепления монослойных культур и фильтруют через сетчатые сита.

После ручного подсчета одиночных диссоциированных клеток поместите их в 96-луночные пластины со сверхнизким прикреплением с плотностью 400 ячеек на лунку. Затем поместите клетки в инкубатор при температуре 37 градусов Цельсия на ночь. На следующий день добавьте различные концентрации GTCpFE до конечного объема 100 микролитров.

Проводите каждую процедуру в трех экземплярах. После семи дней культивирования в инкубаторе при температуре 37 градусов Цельсия получите изображения с помощью программного обеспечения для визуализации с помощью инвертированного микроскопа. Вручную посчитайте количество маммосфер диаметром более 75 микрон.

Чтобы измерить высокий уровень CD44 и низкий уровень CD24 в иммунофенотипе раковых стволовых клеток, трипсонизируйте клетки MDA-MB-231 0,25% трипсина в течение пяти минут при температуре 37 градусов Цельсия. После подсчета клеток с помощью гемоцитометра засейте клетки по три миллиона клеток на чашку в 10 миллилитрах среды, как описано в текстовом протоколе. Затем добавьте в клетки носитель или GTCpFE и инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия в течение 72 часов.

После инкубации трипсинизируют клетки и распределяют один миллион трипсинизированных клеток в пятимиллилитровых полистирольных пробирках. Пробирки должны содержать два миллилитра 1x HBSS буфера с добавлением 2% FBS и иметь маркировку как тестовые или контрольные. Чтобы окрашивать поверхностный маркер CD44 и CD24, поверните клетки вниз, аспирируйте буфер, затем добавьте 20 микролитров каждого конъюгированного антитела и 80 микролитров буфера HBSS в пробирки для получения конечного объема 100 микролитров.

Далее добавьте в контрольные трубки 100 микролитров того же буфера. Также включают CD44 APC-конъюгированное антитело и антитело CD24 PE с одиночным окрашиванием или контроль иммуноизотипа ITG. Инкубируйте клетки в темноте при температуре четыре градуса Цельсия в течение 30 минут.

Раскрутите клетки в течение пяти минут в 400 раз больше g и восстановите их в буфере объемом 200 микролитров. Держите клетки на льду и в темноте. Теперь можно выполнять анализ FACS.

GTCpFE ингибирует активность люциферазы NFkappaB-RE и экспрессию генов-мишеней NFkappaB, таких как молекула межклеточной адгезии 1, лиганд 2 мотива хемокина C-C и фактор некроза опухоли в клетках рака молочной железы MCF-7. Расчетная ингибирующая концентрация на 50% обеих конечных точек составляет примерно 20 микромолярных GTCpFE. Для сравнения, 200 микромолярный аспирин не проявляет ингибирующей активности в клетках рака молочной железы.

Это указывает на то, что пролекарственная стратегия добавления фармакора фумарата к аспирину значительно улучшает его анти-NFkappaB активность. GTCpFE ингибирует образование маммосферы клеток рака молочной железы MDA-MB-231 дозозависимым образом. Подобно ингибированию пути NFkappaB в адгезивных культурах, значение IC50 для формирования маммосферы составляет примерно 20 микромоляров.

Также была измерена популяция клеток, экспрессирующих высокий уровень CD44 и низкий иммунофенотип CD24, который является полноценным маркером поверхности раковых стволовых клеток при раке молочной железы. Претернамент GTCpFE приводил к значительному истощению популяции CD44 с высоким и низким уровнем CD24 в клетках MDA-MB-231. Вместе эти результаты устанавливают способность GTCpFE эффективно воздействовать на стволовые клетки рака молочной железы.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как происходит разработка и синтез в аспирине фумарата пролекарства и как охарактеризовать его анти-NFkappaB и противораковую активность стволовых клеток на клетках рака молочной железы. Впервые у нас появилась идея этого метода, когда аспирин не смог ингибировать путь NFkappaB в клетках рака молочной железы, как это ранее сообщалось в литературе. Применение этого метода распространяется на противораковую терапию стволовыми клетками, потому что мы показали, что, нацеливаясь на несколько провоспалительных путей, мы можем, по сути, эффективно уничтожить стволовые клетки рака молочной железы.

Хотя этот метод может дать представление о том, как разрабатывать, синтезировать и характеризовать противовоспалительные агенты при раке молочной железы, он может быть применен к другим злокачественным новообразованиям, где множественные провоспалительные пути активны и способствуют патологии заболевания. После этой процедуры можно использовать другие методы, такие как анализ альдефтора и иммуногенность in vivo, для оценки влияния препарата на стволовые клетки рака молочной железы. Этот метод может проложить путь для исследователей в области терапии рака к изучению пролекарственного дизайна противовоспалительных агентов.

GTCpFE может послужить прототипом для разработки новых противовоспалительных средств на основе фумарата и аспирина. И это также может стать основой для нового класса противораковых агентов стволовых клеток.