Использование моноцитов монослоя анализе для оценки Fcγ рецептор-опосредованного Фагоцитоз

Общей целью данного функционального анализа in vitro является оценка различных аспектов ФК-опосредованного фагоцитоза. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области иммуногематологии и медицины переливания крови, например, каково клиническое значение ауто- и аллоантител к эритроцитам. Этот метод обеспечивает функциональный биологический анализ, который может быть выполнен in vitro для прогнозирования исхода переливания крови у пациентов с предварительно сформированными антителами против эритроцитов.

Демонстрировать процедуру будет Синди Тонг, аспирантка из моей лаборатории. Теперь не забывайте, что работа с человеческой кровью может быть опасной, и что при выполнении этой процедуры всегда следует соблюдать меры предосторожности, такие как ношение защитных халатов и перчаток. После получения от одного до двух образцов цельной крови по 10 мл от здорового донора в вакутайнерных пробирках, содержащих кислый цитрат декстрозу, путем венепункции, пробирки помещают в шкаф биобезопасности класса II, а кровь разбавляют в соотношении один к одному в теплой полной среде.

Затем медленно направьте клетки крови вниз по стенкам центрифужной пробирки на градиент плотности комнатной температуры, стараясь не смешивать слои. Разделите ячейки центрифугированием. Затем выбросьте верхний слой плазмы и с помощью стеклянной пастеровской пипетки перенесите PBMC, содержащую охристую оболочку, в новую 15-миллилитровую пробирку.

Трижды промыть выделенные ПБМК в PBS, повторно суспендируя клетки в трех-семи миллилитрах среды после третьего центрифугирования. После подсчета разбавьте клетки до 1,75 умножить на 10 до шестой клетки на миллилитр концентрации в полной среде и высейте по 400 микролитров клеток в каждую лунку восьмикамерного стекла для одночасовой инкубации при 37 градусах Цельсия и 5% CO2 при полной влажности. Чтобы опсонизировать эритроциты R2R2, сначала трижды промойте эритроциты в PBS.

Разбавляют гранулу R2R2 после третьего центрифугирования в соотношении один к одному с поликлональными анти-D антителами из сыворотки крови человека в течение одного часа при температуре 37 градусов Цельсия с прерывистым перемешиванием. По окончании опсонизации извлеките клетки из инкубатора, а затем промойте их еще три раза в PBS, как показано только что. Ресуспендируйте гранулу до 1,25% объема в полной среде RPMI.

Затем замените надосадочную жидкость из каждой лунки восьмикамерного стекла на 400 микролитров опсонизированных ячеек R2R2 в течение двух часов при температуре 37 градусов Цельсия. В конце инкубации с помощью адаптеров для затвора снимите камеры, промокнув излишки R2R2 бумажным полотенцем. Теперь наполните стакан объемом 100 миллилитров PBS и медленно окуните каждое предметное стекло от 30 до 40 раз в раствор соли, чтобы удалить большую часть нефагоцитированного R2R2.

После высыхания зафиксируйте предметные стекла в 100% метаноле на 45 секунд и дайте ячейкам высохнуть, прежде чем устанавливать образцы с покровными стеклами. На следующий день загрузите каждое предметное стекло на фазово-контрастный микроскоп с объективом 40X и вручную подсчитайте не менее 200 моноцитов и количество фагоцитированных R2R2 в каждом моноците, используя по одному счетчику в каждой руке, чтобы одновременно количественно определить количество моноцитов и количество фагоцитированных клеток R2R2 в образце. Внутривенное введение иммуноглобулина связывается с FC-рецепторами и блокирует их, ингибируя фагоцитоз, дозозависимым образом, с почти 100% ингибированием, наблюдаемым начиная с концентраций 200 мкг внутривенного иммуноглобулина на миллилитр, и почти без ингибирования, наблюдаемым при концентрациях ниже 0,5 мкг ингибитора.

Когда фагоцитарные индексы нормализуются до положительного контроля R2R2 как 0% ингибирования, можно определить кривую торможения с IC 50 в три микрограмма на миллилитр. С учетом опыта, фазово-контрастная микроскопия может быть использована для дифференциации моноцитов от загрязняющих эритроцитов и вакуолей от фагоцитированных эритроцитов. Во время количественного определения следует избегать плотных клеточных кластеров и мусора, а также чрезмерной опсонизации эритроцитов R2R2, что может привести к усиленному фагоцитозу, который переполняет внутреннюю часть моноцитов и препятствует точному анализу фагоцитов.

После освоения этой техники ее можно выполнить за шесть-восемь часов, если она выполнена правильно. После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как иммуноцитохимия или иммунофлуоресценция с использованием конфокальной микроскопии, чтобы ответить на дополнительные вопросы о экспрессии фагоцитарных белков, взаимодействиях эритроцитов и компартментализации. С момента своего первоначального развития и дальнейшей оптимизации этот метод будет информировать исследователей в области трансфузионной медицины и клеточной биологии о том, как они изучают системы опсонизации.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как проводить анализ моноцитарного монослоя для оценки типов взаимодействия антител, провоцирующих фагоцитоз.