Одноклеточная РНК-Seq определенных подмножеств клеток сетчатки ганглия

Здесь мы представляем комбинаторный подход для классификации типов нейронных клеток до выделения и для последующей характеристики одноклеточных транскриптомов. Этот протокол оптимизирует подготовку образцов для успешного секвенирования РНК (РНК-Seq) и описывает методологию, разработанную специально для углубленного понимания клеточного разнообразия.

Общая цель этой процедуры заключается в выделении флуоресцентно меченых одиночных клеток из живой целой сетчатки. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы нейробиологии. Например, сколько существует подтипов определенного класса нейронов и каковы генетические маркеры для каждого подтипа?

Основное преимущество этого метода заключается в том, что мы отказываемся от необходимости диссоциации тканей сетчатки, что позволяет клеткам выживать в более здоровой среде до изоляции. Применение этого метода распространяется на любую популяцию флуоресцентно меченых клеток и, таким образом, может быть применено к другим системам для понимания клеточного разнообразия и функции в норме и при заболеваниях. Как правило, люди, плохо знакомые с этим методом, будут испытывать трудности, потому что этот метод основан на способности исследователя зажать клетку без ущерба для жизнеспособности клетки.

Будущая демонстрация этого метода имеет решающее значение, поскольку этапы выделения РНК могут быть трудными для изучения, потому что небольшое количество РНК может легко деградировать, если с ним не обращаться правильно и быстро. Чтобы начать эту процедуру, проткните роговицу иглой и отрежьте ее на границе роговицы и склеры. Затем снимите линзу с помощью щипцов.

Аккуратно сделайте разрыв в склере и разрежьте зрительный нерв там, где встречаются сетчатка и склера. Аккуратно закончите удаление склеры с сетчатки. Далее удалите прозрачное стекловидное тело.

Разрежьте сетчатку пополам и храните их в насыщенном кислородом внеклеточном растворе при комнатной температуре до использования. Когда ткань будет готова к установке в записывающую камеру, перенесите кусочек сетчатки в раствор фермента, разведенный в 500 микролитрах оксигенированного внеклеточного раствора в чашке Петри, и инкубируйте его в течение двух минут при комнатной температуре на шейкере. Затем промойте сетчатку в насыщенном кислородом внеклеточном растворе и перенесите ее в камеру для записи со стеклянным дном с помощью пластиковой пипетки для переноса.

После этого с помощью щипцов аккуратно расплющиваем ткань фоторецепторным слоем вниз. Удалите лишнюю жидкость с помощью пипетки и закрепите ткань с помощью платинового кольца с нейлоновой сеткой. Затем заполните камеру кислородосодержащим внеклеточным раствором и установите ее на предметный столик микроскопа.

Перфузируйте ткань кислородосодержащим внеклеточным раствором со скоростью от двух до четырех миллилитров в минуту. Чтобы подготовиться к этой процедуре, проведите пульсацию нескольких стеклянных микропипеток для электрофизиологической записи с помощью съемника микропипеток. Наблюдайте за слоем ганглиозных клеток с помощью ИК-ДIC оптики.

Затем определите GFP плюс ганглиозные клетки с помощью эпифлуоресценции на глубине около 480 нанометров. Далее найдите пипетку, наполненную внутриклеточным раствором, в ДВС-синдроме. Приложите небольшое положительное давление и обнулите смещения напряжения на усилителе.

Затем опустите стеклянную микропипетку на ячейку с положительным результатом GFP и примените действия команды испытательного напряжения для контроля сопротивления свариванию. Отрицательное давление должно образовывать гигаомное уплотнение между пипеткой и клеточной мембраной. После формирования стабильного уплотнения разорвите мембрану, применяя короткие импульсы отрицательного давления, чтобы получить доступ ко всей клетке.

Подождите одну-две минуты, пока дендриты клетки заполнятся флуоресцентным индикатором. На этом этапе осторожно извлеките содержимое цитоплазмы клеток в пипетку, оказывая отрицательное давление с помощью десятимиллилитрового шприца. В то же время контролируйте экстракцию при ДВС-синдроме, визуализируя уменьшение размера тела клетки.

После извлечения цитоплазматического содержимого осторожно оторвите пипетку от ткани и быстро извлеките пипетку из раствора. Затем быстро извлеките пипетку из держателя Headstage и кратко промойте наконечник пипетки H2O, обработанной DEPC. Затем подсоедините пипетку к шприцу объемом в один миллилитр с помощью плотно прилегающей трубки.

Немедленно изгоните клетки в десять микролитров лизисного буфера, по одному в 0,2 миллилитровые ПЦР-пробирки. Кратковременно центрифугируйте пробирки в настольной мини-центрифуге при 2000 умноженных на g в течение десяти секунд. После этого сразу же заморозьте образцы на сухом льду на пять минут.

После заморозки храните их при температуре минус 80 градусов Цельсия до двух недель для достижения наилучших результатов. Чтобы подготовиться к этой процедуре, настройте магнитное сепараторное устройство, прикрепив верхнюю часть перевернутого держателя наконечника P20 или P200 к магнитной подставке на 96 лунок. Затем приготовьте свежий 70% этанол из расчета примерно один миллилитр на образец.

Извлеките магнитные шарики РНК из хранилища при температуре 4 градуса Цельсия и разморозьте их при комнатной температуре. Как только шарики РНК достигнут комнатной температуры, переведите их на вихрь в течение 30 секунд, чтобы убедиться, что раствор хорошо перемешался. После этого разморозьте ячейки при комнатной температуре в течение одной минуты.

Затем добавьте пять микролитров H2O, не содержащей РНКазы, в каждый образец и пипетируйте вверх и вниз. После этого добавьте 22 микролитра шариков РНК в каждую пробирку и тщательно перемешайте. Инкубируйте образцы при комнатной температуре в течение пяти минут, чтобы РНК взаимодействовала и связывалась с магнитными шариками.

После этого поместите пробирки на магнитный сепаратор на восемь минут. Прежде чем продолжить, убедитесь, что надосадочная жидкость чиста. Следите за бусинами из одной палитры и следите за тем, чтобы не оторвать ее от боковой стороны трубки во время пипетирования.

Удалите надосадочную жидкость из образцов и добавьте 150 микролитров 70%-ного этанола. Затем удалите этанол и повторите стирку еще два раза. Дайте образцам высохнуть на воздухе в течение шести минут.

Периодически проверяйте, не собралось ли больше этанола на дне пробирки, и удалите его соответствующим образом. Помните, что очень важно правильно сушить бусины. Если гранулы недостаточно сухие, этанол может проникнуть через элюент и снизит общий выход, в то время как чрезмерно высушенные гранулы могут привести к потере РНК.

Пока образцы высыхают, приготовьте 10-кратный реакционный буфер, соединив 19 микролитров буфера для лизиса два и один микролитр ингибитора рназы. Кратковременно раскрутите его и держите на льду. Когда образцы высохнут и гранулы перестанут выглядеть глянцевыми, извлеките пробирки из магнитного сепаратора и добавьте 9,5 микролитров H2O, не содержащей Rnase, для регидратации образцов.

Затем поместите образцы на лед и добавьте по одному микролитру 10-кратного реакционного буфера к каждому образцу. На этом изображении показан слой ганглиозных клеток сетчатки, визуализированный с помощью ИК-ДВС в полном препарате сетчатки. Тот же препарат был визуализирован в эпифлуоресценции на глубине около 480 нанометров для идентификации GFP-положительных ганглиозных клеток.

На этом изображении показана GFP-положительная клетка, которая была нацелена для записи патч-клэмпа и заполнена флуоресцентным индикатором. Конфокальное изображение дендритов ipRGC, полученное во включенной и выключенной субпластинке внутреннего плексиформного слоя, позволяет классифицировать эти типы клеток. Полосы с первой по третью показывают идеальные мазки ДНК, в то время как четвертая полоса представляет собой плохо обработанный образец.

Контрольная полоса должна содержать два чистых пика при размерах маркеров 35.о. и 10380.о. Ниже приведена подробная трассировка одной успешно подготовленной библиотеки с высокой интенсивностью около 2 кб. Этот след также демонстрирует успешную подготовку, но с центром мазка около 500.н.

На этом изображении показаны выходные данные биоанализатора после мечения, амплификации и очистки образцов. Подробную трассировку успешно помеченного образца можно увидеть здесь, соответствующую образцу на первой полосе. Неполная маркировка приведет к появлению следов, подобных тому, который виден здесь, что требует повторной ретаментации с помощью свежего разведения.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как выделить РНК из флуоресцентно меченых типов клеток в интактной сетчатке. Пытаясь провести эту процедуру, важно помнить, что РНК очень чувствительна к деградации и что наличие здоровых клеток сетчатки является ключевым фактором. После освоения этой техники ее можно сделать за два дня, если она выполнена правильно.

После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как количественная ПЦР, гибридизация NC2 или иммуногистохимия, чтобы ответить на дополнительные вопросы, например, являются ли идентифицированные гены специфичными для данного клеточного подтипа. Этот метод проложил путь исследователям в области нейробиологии, пытающимся понять гетерогенность нейронов в различных областях мозга. Понимание этой гетерогенности позволит в будущем проводить исследования клеточной функции и связности в молекулярно идентифицированных популяциях.