Жир тела орган культуры системы в Aedes Aegypti, вектор вируса Зика

Здравствуйте, меня зовут Иммо Хансен, я из лаборатории молекулярной векторной физиологии Университета штата Нью-Мексико. Система культивирования жира комара, которую мы продемонстрируем сегодня, представляет собой систему культивирования органов in vitro, которую мы используем в нашей лаборатории для изучения физиологии и метаболизма живой жировой ткани, прикрепленной к стенкам брюшной полости комара. Жировое тело насекомого – это орган, в котором происходит множество обменных процессов.

Его функции аналогичны функциям печени и жировых тканей позвоночных. Мы использовали эту систему для изучения регуляции производства белка желтка и механизмов поглощения питательных веществ комарами желтой лихорадки Aedis aegypti. Aedi aegypti является основным переносчиком арбовирусов, таких как денге, чикунгунья и зика.

Жировое тело комара является единственным источником белков желтка у комаров. В этом видеопротоколе демонстрируется система культивирования жира комаров in vitro и показано несколько экспериментальных применений этой системы. Протокол, который мы будем демонстрировать, состоит из нескольких частей.

Во-первых, мы подготовим растворы и реагенты, необходимые для системы культивирования жира в организме. Во-вторых, мы будем проводить вскрытие комаров, чтобы изолировать жировые тела. Затем, и последнее, мы перенесем изолированные жировые тела в среду, обогащенную аминокислотами, чтобы активировать синтез белка желтка.

Существует несколько последующих применений, которые могут быть выполнены после культивирования жирового тела. Сегодня мы проведем культуру жирового тела с последующим секвенированием нового поколения. Мы сравним два образца, нестимулированный образец с одним образцом, стимулированным аминокислотами и экдизоном.

Дополнительные материалы и оборудование, которые потребуются, включают аспиратор с флаконом для сбора комаров, подушечку для мух CO2, подключенную к баллону с газом CO2, этанол для очистки подушечки от мух, стереомикроскоп с источником света, микроножницы для препарирования, пинцет с тонким наконечником и 96 луночных планшетов. Для подготовки к культуре жирового тела необходимо приготовить три исходных раствора и реагента: аминостоковый раствор, физиологический солевой исходный раствор Aedes и стоковый раствор кальция. Физиологический раствор физиологического раствора Aedes и раствор кальция смешивают для получения питательной среды для жировых культур

Комары, используемые для этого эксперимента, должны быть не моложе трех дней после появления появлений. Используя аспиратор с питанием от батареек, соберите комаров в флакон для сбора. Поместите флакон со сбором вместе с образцом на салфетку с CO2, чтобы обезболить комаров.

В качестве альтернативы для обезболивания комаров можно использовать лед. Откажитесь от всех самцов перед началом вскрытия. Сначала сфокусируйте препарирующий микроскоп с помощью тестового комара, чтобы обеспечить видимость.

После того, как вы сфокусировали микроскоп, поместите на микроскоп вогнутое предметное стекло и поместите две капли APS в центр. APS помогает поддерживать комара на высоком уровне и собирать различные органы комара. Выберите комара с помощью щипцов, взяв его за ноги.

Снимите ножки. Удерживая комара за грудную клетку левой рукой, с помощью других щипцов захватите комара за последние два или три сегмента брюшка и осторожно потяните, чтобы снять. Это действие должно удалить яичники, мальпигиевые канальцы, заднюю кишку, среднюю кишку и урожай.

После того, как органы будут удалены, с помощью пружинных ножниц завершите рассечение жирового тела. Вставьте одно лезвие в отверстие, которое образовалось в результате удаления последних двух-трех сегментов брюшка и разрежьте брюшко вдоль, пока оно не достигнет сегмента ниже грудной клетки. После разреза брюшная полость должна расширяться наружу.

Еще один разрез делается латерально в верхней части брюшной полости в том месте, где закончился первый разрез. После разрезов живот раскрывается и плавает кутикулой вверх, а жировые тела находятся внутри АФС. После того, как жировые тела уравновесятся на растворе APS в течение не менее получаса, их можно перенести на питательную среду для жировых организмов.

Чтобы стимулировать жировые тела к началу экспрессии гена белка желтка, мы переносим их в среду с высоким уровнем свободных аминокислот и стероидного гормона насекомых, 20-гидроксиэкдизона. После переноса жировые тела инкубируются в течение шести часов в среде. После инкубационного периода жировые тела переносят в пробирку Эппендорфа с буфером, подходящим для желаемых анализов.

В зависимости от цели эксперимента, жировые тела могут быть использованы в нескольких последующих протоколах, таких как количественной ПЦР, вестерн-блоттинг, протеомика, метаболомика или РНК-секвенирование. В качестве примера мы провели эксперимент по культивированию жировых тел и стимулировали изолированные жировые тела путем их инкубации на растворе, содержащем сбалансированную смесь всех 20 встречающихся в природе аминокислот и стероидного гормона насекомых 20-гидроксиэкдизона в течение шести часов, в то время как контрольные жировые тела инкубировали на PS в течение такого же количества времени. На этом рисунке представлены результаты анализа РНК-секвенирования нашего эксперимента.

Тепловая карта показывает уровни экспрессии генов 1256 генов, экспрессируемых в культивируемых жировых телах при двух различных обработках. Все эти гены значительно изменили уровни экспрессии между двумя видами лечения. В этой таблице показаны десять наиболее активно регулируемых генов после активации культивируемых жировых тел аминокислотами и 20-гидроксиэкдизоном.

Как и ожидалось, большинство из этих генов являются генами белка желтка. Благодарим вас за проявленный интерес к культуре тела комаров.