Измерение сигнальной связи рецептора с G-белком с помощью радиомаркированного связывания GTP

Общая цель этой процедуры заключается в выделении клеточных мембран, содержащих рецепторы, сопряженные с G-белком, или GPCR, и в изучении фармакологии GPCR с использованием эссе по связыванию функционального GTP. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области биохимии относительно фармакологических свойств установленных или орфанных рецепторов, сопряженных с G-белком. Основные преимущества заключаются в том, что он прост, быстр и измеряет наиболее непосредственное событие в передаче сигналов рецепторов, сопряженных с G-белком.

Сначала поместите эмбриональные клетки почки человека на 10-сантиметровый планшет для культуры тканей в 10 миллилитрах полного DMEM. Инкубируйте клетки при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа, пока не будет достигнуто слияние от 70% до 80%. После инкубации трансфектируйте клетки препаратом HAMOR1 с использованием подходящего реагента для трансфекции в соответствии с рекомендациями производителя.

Затем инкубируйте клетки, как описано выше, в течение 36-48 часов. После извлечения трансфицированных клеток из инкубатора аспирируйте среду и промойте клетки пятью миллилитрами ледяного PBS. Затем отсасывайте PBS и лишнюю жидкость из тарелки.

Далее добавляем в ячейки 600 микролитров буфера 1. С помощью скребка для клеток вытесните клетки с поверхности планшета и пипетируйте клеточную суспензию в микроцентрифужную пробирку объемом 1,6 миллилитров. Сразу же заморозьте микроцентрифужную пробирку в жидком азоте.

Как только образец застынет, разморозьте лизаты на льду. После того, как лизаты оттают, используйте гомогенизатор с одной импульсной микротрубкой, чтобы вскрыть клетки. Импульсируйте этот гомогенизатор от трех до пяти раз в течение 10 секунд.

Поместите трубку на лед на 30 секунд между импульсами. После этого центрифугируйте образец в течение 10 минут при 1000 g и четырех градусах Цельсия. Затем перенесите надосадочную жидкость в новую микроцентрифужную пробирку объемом 1,6 миллилитра на льду.

Повторно суспендируйте нёбо в 100 микролитрах буфера 1. Повторно гомогенизируйте образец и импульсируйте гомогенизатор от трех до пяти раз в течение пяти секунд, помещая пробирку на лед на 30 секунд между импульсами. После повторного центрифугирования образца соедините надосадочную жидкость и центрифугируйте в течение 20 минут при 11 000 g и четырех градусах Цельсия.

Перенесите надосадочную жидкость в новую микроцентрифужную пробирку объемом 1,6 миллилитров. Повторно суспендируйте в 200 микролитрах буфера 2. Затем гомогенизируйте нёбо, растирая его от трех до пяти раз.

После центрифугирования образца и аспирации надосадочной жидкости повторно суспендируйте нёбо, содержащее сырую мембранную фракцию, в 50 микролитрах буфера 2. Разбавьте массовый S35GTP гамма-S до 50 наномоляров и 10 миллимолярных следовых HCl и 10 миллимолярных DTT. Сделайте 250 микролитровых литров в час для экспериментов по связыванию и при желании заморозьте для хранения.

Затем приготовьте полный связывающий буфер или CBB, добавив неполный связывающий буфер, чтобы включить конечную концентрацию одного миллимолярного DTT, 0,1% BSA, 10 микромолярного GTP и 0,1 наномоляра S35GTP gamma S. После размораживания мембранной фракции на льду разбавьте ее до концентрации 100 микрограмм на миллилитр и неполного связывающего буфера. Чтобы изучить влияние пептида DAMGO на связывание ГТФ через MOR1, приготовьте серию разведений DAMGO и CBB до конечного объема 100 микролитров. Чтобы оценить связывание базилика с ГТФ, приготовьте микроцентрифугу объемом 1,6 мл со 100 микролитрами CBB.

Чтобы оценить неспецифическое связывание, приготовьте микроцентрифужную пробирку объемом 1,6 мл с 99 микролитрами КБК с добавлением одного микролитра двухмиллимолярной нерадиальной меченой ГТФ гамма S. Теперь добавьте по 100 микролитров разбавленного мембранного раствора в каждый образец. Инкубируйте образцы в течение 30 минут при температуре 25 градусов Цельсия в термомиксере при 300 оборотах в минуту. Предварительно замочите стекловолоконные фильтры в дистиллированной воде на 10 минут.

После извлечения образцов из термомиксера, кратковременно импульсно вращайте их в течение пяти секунд, чтобы собрать каждый образец на дне пробирки. Далее снимите крышку вакуумного фильтрационного аппарата и установите предварительно замоченные фильтры на вакуумные порты аппарата. Снова закройте крышку аппарата, чтобы образовалось вакуумное уплотнение, и включите вакуум.

Нанесите пипеткой 195 микролитров каждого образца на фильтры. Промойте фильтры три раза одним миллилитром ледяного буфера для стирки. Поместите пять миллилитров сцинтилляционных счетных флаконов в счетную решетку.

Добавьте в каждый флакон по пять миллилитров сцинтилляционной жидкости. Далее выключите вакуум и снимите крышку вакуумного фильтрационного аппарата. С помощью пинцета наберите фильтры из вакуумных отверстий фильтрационного аппарата и опустите каждый фильтр в сцинтилляционный флакон.

Надежно укупорив каждый флакон, инкубируйте образцы в орбитальном вибростенде при температуре 25 градусов Цельсия в течение 10 минут. После этого включите сцинтилляционный счетчик, запрограммируйте счетчик на измерение эмиссии изотопов серы-35 в течение пяти минут на образец с помощью стандартной соответствующей программы сцинтилляции и нажмите «Пуск» для учета. Самофракционирование, чисто отделяет мембранные белки от ядерного белка гистона h2b и цитоплазматического белка глицерина для сокрытия трех фосфатдегидрогеназы.

Белки обогащаются соответствующими субклеточными фракциями. Представитель красителя Понсо демонстрирует одинаковую белковую нагрузку в каждой фракции. Несколько фармакологических параметров могут быть использованы для характеристики взаимодействия лиганда GPCR с помощью экспериментов по связыванию ГТФ, таких как EC50 и коэффициент Хилла.

Здесь показано отзывчивое связывание ГТФ с MOR1 после лечения DAMGO. Этот график иллюстрирует агонистическую активность DAMGO в антагонизме налоксона на передачу сигналов G-белка MOR1. После освоения эта техника может быть выполнена за два-четыре часа, в зависимости от количества экспериментальных условий.

При попытке выполнить эту процедуру важно помнить, что концентрации лиганда GPCR должны быть как минимум на пять порядков выше и ниже ожидаемого EC50. После этой процедуры оценка молекул, структурно сходных с интересующим вас лигандом, может помочь определить важные структурные фрагменты в лиганде, которые определяют профиль лиганда рецептора. После своего развития этот метод помог в открытии лекарств и проложил путь исследователям к детальному изучению аспектов передачи сигналов GPCR, таких как смещенный агонизм.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как выделять клеточные мембраны и измерять фармакологические свойства GPCR с помощью радиометеных GTP. Не забывайте, что работа с радиацией может быть крайне опасной. Следует принимать меры предосторожности, такие как ношение соответствующих средств индивидуальной защиты и работа в лабораторной одежде, соответствующей радиационному излучению.

Перед выполнением этой процедуры следует ознакомиться с институциональными рекомендациями по работе с радиоактивностью.