Методы классификации цитоплазматических фокусов в качестве гранул стресса млекопитающих

Общая цель этого рабочего процесса состоит в том, чтобы определить, являются ли очаги, идентифицированные в цитоплазме, настоящими стрессовыми гранулами, которые представляют собой гранулы РНК, играющие важную роль в физиологии клетки. Основное преимущество этого рабочего процесса заключается в том, что он проверяет все фундаментальные свойства гранул напряжения. Хотя этот рабочий процесс представлен для клеток U-2 OS при остеосаркоме человека, он также может быть применен к другим типам клеточных линий и первичным клеткам.

Как правило, люди, плохо знакомые с этим методом, испытывают трудности, потому что не все стресс-индуцированные очаги являются стрессовыми гранулами. Наш рабочий процесс включает в себя все эксперименты, необходимые для их различения. Я продемонстрирую эту процедуру с Анаис Авлус.

Мы являемся постдокторантами в лаборатории Пола Андерсона и Павла Иванова. Для начала затравите ячейки на покровные листы, размещенные в 24 луночных планшетах, как описано в текстовом протоколе. После ночной инкубации отсасывайте питательную среду из лунок В1 в В4 и из С1 в С4 из 24-луночного планшета.

В лунки В1 и В2 добавить 500 микролитров среды с добавлением 100 микромоляров арсенита натрия, затем в лунки В3 и В4 добавить 500 микролитров среды, обогащенной 50 микромолярами арсенита натрия. Далее в лунки С1 и С2 добавить 500 микролитров среды, содержащей 150 микромолярного винорелбина. Наконец, добавьте 500 микролитров среды, дополненной 125 микромолями винорелбина, в лунки С3 и С4. Выдержите тарелку в течение 30 минут при температуре 37 градусов Цельсия. После 30 минут инкубации добавьте в ячейки во второй колонке пять микролитров по одному миллиграмм на миллилитр раствора циклогексимида и в ячейки в четвертой колонке по два микролитра по 1,25 мг на миллилитр пуромицина. Аккуратно встряхните пластину, чтобы смешать растворы, и верните тарелку в инкубатор еще на 30 минут инкубации.

Чтобы зафиксировать ячейки, удалите среду из лунок и промойте ячейки примерно 250 микролитрами PBS. Добавьте примерно 250 микролитров буферного 4% раствора параформальдегида для фиксации клеток, убедившись, что верхняя часть покровного стекла полностью покрыта. Затем оставьте тарелку на скамейке-качалке при комнатной температуре на 15 минут.

Далее удалите и правильно выбросьте параформальдегид. Добавьте примерно 250 микролитров ледяного метанола, чтобы проникнуть и сплющить клетки. Выдержите пластину еще пять минут при комнатной температуре на качалке.

Как только пермеабилизация будет завершена, отбросьте метанол и заблокируйте клетки, применяя примерно 250 микролитров блокирующего буфера в течение одного часа при комнатной температуре. Затем приготовьте первичный раствор антитела, добавив 12 микролитров антител против G3BP1, eIF4G и eIF3B в три миллилитра блокирующего буфера. Добавьте по 250 микролитров раствора антитела в каждую лунку 24-луночного планшета.

Выдержите пластину на коромысле не менее одного часа при комнатной температуре. После одного часа инкубации удалите раствор антител и промойте клетки примерно 250 микролитрами PBS в течение пяти минут. Затем добавьте 12 микролитров антител Anti-Mouse Cy2, Anti-Rabbit Cy3 и Anti-Goat Cy5 вместе с тремя микролитрами красителя крючков в три миллилитра блокирующего буфера для приготовления вторичного раствора антитела.

Добавьте по 250 микролитров раствора вторичного антитела в каждую лунку и накройте пластину для защиты образцов от света. Выдержите пластину на коромысле при комнатной температуре в течение одного часа. Когда инкубация будет завершена, удалите раствор антител и промойте клетки PBS в течение пяти минут.

Нагрейте монтажный материал в термоблок с температурой 37 градусов Цельсия в течение 10 минут для снижения вязкости. Затем с помощью предварительно отрезанного наконечника для пипетки объемом 200 микролитров поместите 25 микролитров монтажной среды на предметное стекло с этикеткой. С помощью тонких щипцов перенесите покровное стекло из лунки на предметное стекло, перевернув верхнюю часть так, чтобы клетки были обращены к монтажной среде.

Используйте чистый наконечник P200, чтобы прижать покровное стекло. После того, как все покровные стекла будут установлены, удалите излишки монтажной среды, плотно прижав лабораторную салфетку к предметному стеколу. После этого промойте предметное стекло водой.

И сразу же промокните его лабораторной салфеткой еще раз. Проникните префиксные клетки, инкубируя их с 250 микролитрами ледяного метанола при комнатной температуре в течение 10 минут. Затем в опорожненные лунки пластины добавьте примерно 250 микролитров 70% этанола и запечатайте пластину с помощью парапленки для предотвращения испарения.

Инкубируйте тарелку при температуре четыре градуса Цельсия на ночь. После ночной инкубации удалите этанол и регидратируйте клетки, добавив 500 микролитров 2XSSC. Выдержите покровные стекла в течение пяти минут на коромысле при комнатной температуре.

Затем выбросьте раствор и добавьте 500 микролитров SSC еще раз. Выдержите в тарелке еще пять минут при слабом помешивании. Затем нанесите слой парапленки на дно печи для гибридизации и нанесите на нее пипетку объемом 25 микролитров буфера для гибридизации.

Перенесите покровное стекло с 24-луночной пластины, перевернув верхнюю часть так, чтобы клетки были обращены к буферу для гибридизации. Инкубируйте покровные стекла при температуре 42 градуса Цельсия в течение 15 минут. Пипеткой 25 микролитров раствора биотина oligo dT нанесите на парапленку в гибридизационной печи.

Затем с помощью щипцов возьмите покровную салфетку и промокните ее край о лабораторную ткань, чтобы удалить излишки буфера для гибридизации. Перенесите покровное стекло в раствор биотина олиго dT, убедившись, что клетки расположены лицевой стороной вниз, и инкубируйте при температуре 42 градуса Цельсия в течение 60 минут. Как только гибридизация будет завершена, добавьте примерно 500 микролитров предварительно подогретого 2XSSC в лунки чашки на 24 лунки.

Затем с помощью щипцов перенесите покровный листок в лунку и выдержите его при температуре 42 градуса Цельсия в течение 10 минут. После дальнейшего окрашивания клеток раствором антитела просмотрите образцы с помощью флуоресцентного микроскопа. Здесь представлены изображения необработанных клеток U-2 OS, которые не содержат гранул или очагов, окрашенных маркерами стрессовых гранул G3BP1, eIF4G и eIF3B.

В клетках U-2 OS, обработанных арсенитом натрия или винорелбином, индуцировалось образование цитоплазматических очагов, содержащих G3BP1, eIF4G и eIF3B. Колокализация этих маркеров была подтверждена анализом линейного сканирования, выполненным для каждого канала при увеличенном увеличении с последующим наложением полученных графиков. Кроме того, цитоплазматические очаги, идентифицированные в обработанных клетках, содержали мРНК, как показано с помощью poly A FISH.

Сигнал oligo dT, локализованный совместно с сигналом G3BP1, подтверждает идентификацию гранул напряжения. После освоения весь этот рабочий процесс может быть выполнен за три дня, если он выполнен правильно. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как проводить иммунофлюоресценцию и флуоресцентную гибридизацию.

Шаги, которые имеют решающее значение для правильной характеристики и идентификации гранул напряжения. Не забывайте, что работа с параформальдегидом может быть чрезвычайно опасной. При выполнении этой процедуры всегда следует соблюдать меры предосторожности, такие как использование СИЗ и достаточная вентиляция.