В естественных условиях Визуализация Cx3cr1^gfp/gfp репортер мышей с спектральные домена оптическая когерентная томография и сканирование лазерная офтальмоскопия

Этот протокол описывает как с высоким разрешением изображений методы, такие как спектральной области оптическая когерентная томография и сканирование лазерная офтальмоскопия могут быть использованы в мелких грызунов, с помощью офтальмологических изображений платформы системы, для получения информации о Толщина сетчатки и Микроглии клеток распределения, соответственно.

Общие цели этой процедуры заключаются в использовании спектральной оптической когерентной томографии и сканирующей лазерной офтальмоскопии для получения информации о толщине сетчатки и распределении микроглиальных клеток соответственно. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области экспериментальной офтальмологии о корреляции между аномалиями сетчатки и накоплением микроглиальных клеток. Основные преимущества этой методики заключаются в том, что эту информацию можно получить в режиме реального времени неинвазивным способом.

После подтверждения отсутствия реакции на мазок роговицы поместите мышь в положение лежа на левой стороне платформы, правой орбитой которой будет обращена к линзе. Нанесите каплю гидроксипропилметилцеллюлозы в жесткой газопроницаемой контактной линзе плюс четыре диоптрии на правый глаз и запустите модуль регистрации. Для B-сканирования выберите опцию «Инфракрасная и оптическая когерентная томография» в разделе «Применение и структура» выберите «Сетчатка» и с помощью микроманипулятора переместите хрусталик к глазу мыши.

Прежде чем фокусироваться на сетчатке, убедитесь, что выбран индикатор декстера глаза, затем с помощью ручки фокусировки увеличивайте сетчатку до тех пор, пока крупные сосуды не станут четко видны на изображении глазного дна в левой части экрана монитора. С помощью микроманипулятора отрегулируйте положение камеры, при необходимости, поворачивая ручку чувствительности для уменьшения или увеличения яркости изображения глазного дна, в зависимости от ситуации. Выберите «Линейное сканирование» в меню «Шаблон» и с помощью микроманипулятора переместите B-скан между верхним и нижним углами окна сканирования оптической когерентной томографии в спектральной области (SD-OCT).

Установите значение параметра «Автоматическое в реальном времени» как минимум на девять, чтобы получить изображение высокого качества, и нажмите «Получить». Когда все изображения будут получены, перенесите контактную линзу из глаза в свежесбалансированный раствор соли и увлажните роговицу свежей каплей гидроксипропилметилцеллюлозы. После того, как левый глаз будет сфотографирован, поверните стандартную оптику на 30 градусов против часовой стрелки, чтобы снять ее, и установите линзу под углом 55 градусов для второго раунда визуализации.

Чтобы оценить автофлуоресценцию, не двигая мышью, выберите на панели управления инфракрасный диапазон и сфокусируйтесь на крупных сосудах сетчатки. Выберите автоматическую флуоресцентную визуализацию и при необходимости отрегулируйте яркость изображения с помощью ручки чувствительности. Нажмите ручку чувствительности один раз и установите автоматическое значение в реальном времени не менее 67.

Когда будет достигнуто автоматическое значение в реальном времени, получите изображение и нажмите ручку чувствительности второй раз, чтобы остановить усреднение. Отрегулируйте фокус так, чтобы визуализировать различные слои сетчатки, если это целесообразно в эксперименте. Когда все изображения будут получены, перейдем к широкоугольному объективу с углом обзора 102 градуса на оптический и визуализируйте автофлуоресценцию в каждом глазу, как только что было показано.

Чтобы вручную измерить толщину сетчатки на каждом изображении, дважды щелкните по имени первого подопытного животного, чтобы открыть ОКТ-скан. Откройте В-скан, полученный с помощью линзы 30 или 55 градусов, и выберите профиль толщины. Щелкните значок Редактировать сегментацию слоя (Edit Layer Segmentations).

Программное обеспечение автоматически определит внутренние ограничивающие и базовые мембраны. Чтобы вручную скорректировать положение мембран, выберите слой, который нужно изменить, а также вариант с красным кружком. Удерживая нажатой кнопку мыши, перемещайте круг для изменения линии до тех пор, пока соответствующий слой не будет расположен правильно, и нажмите «Сохранить и закрыть», чтобы выйти из окна.

В разделе «Слой» выберите «Сетчатка» и нажмите на другое положение на диаграмме, чтобы просмотреть толщину сетчатки для выбранного положения. Затем измерьте толщину сетчатки и желаемое расстояние от диска зрительного нерва и экспортируйте значения в таблицу. В этих репрезентативных одиночных сканированиях SD-OCT мыши, гомозиготной на экспрессию gfp под промотором Cx3cr1, архитектура сетчатки четко визуализирована как на изображениях объектива под углом 30 градусов, так и на 55 градусов.

Тем не менее, высокая отражательная способность сосудистой оболочки наблюдается при сканировании, полученном с помощью 30-градусного объектива. После SD-OCT сканирующая лазерная офтальмоскопия позволяет визуализировать отдельные gfp-положительные клетки микроглии в сетчатке с использованием линзы под углом 55 градусов или 102 градуса с большим покрытием площади глазного дна, полученной с помощью линзы 102 градуса. При сканировании SD-ОКТ, после ручной коррекции внутренней пограничной и базовой мембранных границ сетчатки, обычно наблюдается хорошая корреляция измерения толщины сетчатки между линзами 30 и 55 градусов, когда измеряется одинаковое расстояние от диска зрительного нерва.

После освоения этой техники она может быть выполнена менее чем за пятьдесят минут, если она выполнена правильно. После своего развития этот метод проложил путь исследователям в области экспериментальной офтальмологии к изучению патологии сетчатки у мелких грызунов in vivo.