Изоляции клеток эндотелия прародителем от человеческой пуповинной крови

Цель настоящего Протокола заключается в изоляции эндотелиальной прогениторных клеток из пуповинной крови. Некоторые из приложений включают, используя эти клетки в качестве биомаркеров для выявления пациентов с сердечно-сосудистого риска, лечение ишемической болезни, и создание ткани инженерии сосудов и сердца клапан конструкций.

Общая цель этой процедуры заключается в выделении эндотелиальных клеток-предшественников из пуповинной крови человека. Этот метод описывает выделение эндотелиальных клеток-предшественников из пуповинной крови для их потенциального использования в качестве аутологичных клеток для тканевой инженерии сосудистых трансплантатов. Основное преимущество этой методики заключается в том, что процедуру выделения можно проводить в специализированных средах без необходимости какой-либо аминосортировки.

Выделенные эндотелиальные клетки-предшественники могут быть использованы для изучения неоваскуляризации, и в отчетах также говорится, что эти клетки могут быть использованы в качестве биомаркеров для выявления пациентов с риском сердечно-сосудистых заболеваний. Перед началом процедуры изоляции предварительно обмажьте шесть луночных планшетов двумя миллилитрами свежеприготовленного крысиного хвоста по одному раствору коллагена на лунку. Уравновесьте планшет в инкубаторе с температурой 37 градусов Цельсия и 5% CO2 в течение не менее одного часа.

Затем разбавьте примерно 25 миллилитров пуповинной крови с HBSS в концентрации один к одному. Затем добавьте 20 миллилитров реагента для среды с градиентом плотности в 50-миллилитровую коническую пробирку и осторожно распределите 20 миллилитров разбавленной пуповинной крови по стенке пробирки, чтобы наложить кровь на среду. Разделите клетки центрифугированием с последующим тщательным удалением слоя плазмы.

С помощью шприца, оснащенного иглой 18-го калибра, соберите мононуклеарную клетку, содержащую охристую оболочку, в новую 50-миллилитровую пробирку. И добавить к клеткам равный объем эндотелиальной базальной среды. Промойте клетки центрифугированием и лизируйте эритроциты в образовавшемся нёбе пятью миллилитрами раствора хлорида аммония на льду.

Через 5-10 минут с периодическим встряхиванием соберите клетки центрифугированием и повторно суспендируйте белую гранулу в свежей эндотелиальной питательной среде. После подсчета аспирируйте коллаген из каждой лунки шестилуночной пластины и трижды промойте лунки в PBS. Засейте мононуклеарные ячейки в соотношении от 10 до 7 клеток на два миллилитра среды в концентрации в лунке.

И вернуть тарелку в инкубатор на 24 часа. На следующий день промойте клетки один раз свежей эндотелиальной питательной средой. Затем замените промывку тремя миллилитрами свежей эндотелиальной питательной среды, и верните клетки в инкубатор для клеточных культур.

Используя светлопольный микроскоп, получайте ежедневные изображения клеток, чтобы отслеживать прогрессирование колоний эндотелиальных клеток, отмечая пластины, где возникают колонии, чтобы отслеживать их рост. Когда колонии эндотелиальных клеток достигнут размера около трех миллиметров, покройте колбу с культурой T25 свежим крысиным хвостом и одним коллагеном в течение как минимум одного часа в инкубаторе для клеточных культур. Затем соберите клетки со 150 микролитрами 0,05% трипсина-ЭДТА на лунку в инкубаторе для клеточных культур в течение двух-трех минут.

Аккуратно постукивая по пластине, нужно выбить прикрепленные ячейки. Когда клетки начнут отделяться, немедленно добавьте два миллилитра свежей эндотелиальной питательной среды и втяните клетки в одну коническую трубку объемом 15 миллилитров. Соберите клетки центрифугированием и повторно суспендируйте гранулу в свежей эндотелиальной питательной среде.

После подсчета засейте клетки в покрытой коллагеном колбе в соотношении пять умножить на 10 до пятых клеток в три миллилитра среды на плотность колбы и пометить колбу как проходную. Затем верните колбу в инкубатор, повторно засевая клетки, когда колония достигнет 90% конфлюенции. После посева на обработанные коллагеном пластины, первый рост колонии обычно наблюдается между пятым и девятым днями.

Колонии продолжают расти и приобретают веретенообразную морфологию клеток на ранних стадиях культивирования, которая позже прогрессирует до морфологии, похожей на булыжник. Общее количество клеток, собранных при каждом пассаже, увеличивается в прямой зависимости от общего числа дней в культуре. Вестерн-блоттинг показывает раннюю экспрессию CD 31 и CD 34 культивируемыми эндотелиальными клетками, которая, по-видимому, снижается при последующем пассировании.

Экспрессия второго рецептора фактора роста эндотелия сосудов, однако, сохраняется с течением времени, хотя и на несколько более низком уровне экспрессии, чем тот, который наблюдался после первого пассажа. Следует отметить, что эндотелиальные клетки-предшественники не являются положительными к маркеру мезенхимальных клеток альфа-гладкомышечному актину, в отличие, например, от лизатов клапанных интерстициальных клеток, которые могут быть включены в качестве положительного контроля. Вся процедура изоляции может быть завершена менее чем за пять часов в зависимости от полученной единицы пуповинной крови.

После выделения и посева мононуклеарных клеток в эндотелиальную питательную среду обычно требуется от пяти до девяти дней, чтобы колонии ЭПК проявились в культуре. Предложенный метод выделения использует специализированные среды для культивирования эндотелиальных клеток-предшественников, и позволяет избежать использования проточного цитометра, поскольку требует наличия эндотелиальных маркеров. Этот метод также обеспечивает эффективный протокол для получения большого количества эндотелиальных клеток-предшественников за короткий промежуток времени.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как выделить эндотелиальные клетки-предшественники из единиц пуповинной крови человека. Не забывайте, что пуповинная кровь человека может быть опасной, поэтому следует соблюдать правила правильной утилизации отходов крови и продуктов клеточных культур.