Подготовка и метаболических Assay 3-мерной сфероида Сопредседатель культур клеток поджелудочной железы и фибробластов

Здесь описан метод для подготовки совместного культуры трехмерные (3D) сфероида поджелудочный рак клеток и фибробластов, следуют измерения метаболических функций, с помощью анализатора внеклеточного потока.

Общая цель данной методологии заключается в совместном культивировании трехмерных сфероидов опухолевых стропов из раковых клеток поджелудочной железы и фибробластов для их метаболической оценки с использованием анализатора внеклеточного потока. Этот метод может помочь ответить на вопросы о влиянии опухолевого мико на клеточный метаболизм и чувствительность к препаратам. Основные преимущества этих методов заключаются в том, что они быстры, относительно просты и легко воспроизводимы, а также могут быть легко адаптированы к другим случаям выравнивания клеток.

Демонстрировать процедуру будут Паван Ноэль и Рубен Муньос. Используя стандартный метод асептического культивирования тканей, культивируйте представляющие интерес раковые клетки и фибробласты в колбах Т75 в соответствующей питательной среде. Когда клетки достигнут 70-80% конфлюенции, промойте культуры один раз в пяти миллилитрах PBS и отделите клетки от поверхностей колб двумя миллилитрами 0,05% трипсина ЭДТА на колбу в течение пяти минут при температуре 37 градусов Цельсия.

После подтверждения отслойки под микроскопом деактивируйте трипсин восемью миллилитрами питательной среды на колбу и несколько раз проведите пипетку по клеткам, чтобы получить суспензии одиночных клеток для подсчета. Соберите клетки центрифугированием и повторно суспендируйте гранулы в концентрации от 1 x 10 до шестой клетки на миллилитр в свежей питательной среде. Чтобы намагничить клетки, добавьте 10 микролитров наночелнока в питательную среду, измельчите 100 микролитров клеток и осторожно перемешайте растворы.

Аккуратно переверните трубки несколько раз и переложите наночелночные смеси ячеек в отдельные лунки 24-луночной пластины. Инкубируйте клетки при комнатной температуре в течение двух часов, осторожно встряхивая, чтобы облегчить связывание наночелнока с поверхностью клетки. По окончании связывающей инкубации аккуратно перемешать каждую суспензию намагниченных клеток с пипетированием и отрегулировать концентрацию до 1,5 х 10 до четверти намагниченных раковых клеток или фибробластов на 150 мкл среды.

Смешайте фибробласты и раковые клетки в соотношении два к одному, в общей сложности 150 микролитров засеянных клеток на лунку. Поместите 96-луночную пластину с репеллентом на 96-луночный магнитный сфероид с более тонкими магнитами и засейте 150 микролитров клеточной смеси в каждую лунку. Когда все клетки будут покрыты, инкубируйте планшет в течение ночи при температуре 37 градусов Цельсия и 5% CO2, при этом магнитный сфероидальный привод все еще прикреплен.

На следующее утро снимите магнитный привод и верните клетки в инкубатор еще на срок до семи дней. За день до метаболического анализа увлажните картридж зонда 200 микролитрами калибра анализа на лунку в предоставленной рабочей пластине и инкубируйте рабочую пластину в течение ночи во влажном инкубаторе без CO2 при температуре 37 градусов Цельсия. На следующее утро понаблюдайте за сфероидами в ростовой пластинке под световым микроскопом, чтобы проверить их морфологию и общую однородность.

Перенесите пластину роста на магнитный удерживающий привод и осторожно отасуньте примерно 120 микролитров питательной среды на лунку. Аккуратно промойте сфероиды 120 микролитрами подогретой среды для анализа три раза. После последней промывки еще раз осмотрите сфероиды под микроскопом, чтобы подтвердить, что сфероиды не были смыты, и добавьте в каждую лунку по 180 микролитров подогретой пробирной среды.

С помощью наконечника с широким отверстием осторожно отсасывайте один предварительно промытый сфероид из пластины для роста репеллента и аккуратно перенесите сфероид непосредственно в центр одной лунки пластины для анализа сфероида, позволив сфероиду упасть в центральную микрокамеру лунки под действием силы тяжести. Когда все сфероиды будут перенесены, поместите планшет для анализа в инкубатор с увлажненным воздухом без CO2 37 градусов Цельсия на один час. Во время инкубации расположите картридж с датчиком так, чтобы ряды от A до H находились с левой стороны, и поместите направляющую для заряжания в верхнюю часть картриджа таким образом, чтобы буква, соответствующая порту, который необходимо загрузить, находилась в верхнем левом углу.

Если пластина была равномерно нагружена, откройте программное обеспечение для анализа и нажмите шаблоны. Дважды кликните по пустому шаблону и нажмите «Создать группы». На вкладке карты пластин назначьте пробирной пластине группы, соответствующие плану эксперимента, и выберите четыре угловые лунки в качестве фоновых лунок.

На вкладке «Протокол прибора» проверьте цикл калибровки, равновесия и базового уровня измерения. Нажмите кнопку Injections и определите соединение для каждого порта. Измените количество циклов измерения на шесть, просмотрите протокол и сводку по группе, а затем сохраните шаблон дизайна анализа.

Основываясь на схеме анализа в качестве руководства, используйте многоканальную пипетку для дозирования каждого реагента непосредственно в отверстия для инъекций, удерживая направляющие загрузки на месте кончиками пальцев. Когда все реагенты будут загружены, снимите направляющую заряжания и удерживайте картридж на уровне глаз, чтобы визуально осмотреть отверстия для впрыска на предмет равномерной загрузки. Перенесите картридж на рабочую пластину в анализатор внеклеточного потока и начните калибровку перед анализом.

После калибровки замените рабочую пластину на предварительно нагретую пластину для анализа, содержащую 3D-сфероиды, и начните анализ. Когда анализ будет завершен, экспортируйте данные в соответствующее программное обеспечение для анализа данных. В типичном эксперименте диаметр сфероидов увеличивается примерно с 400 микрометров на второй день до почти 600 микрометров на седьмой день, после печати, при этом после седьмого дня значительного увеличения не наблюдается.

Все три типа сфероидных культур демонстрируют биологически функциональную реакцию на анализ гликолиза на стресс в ответ на инъекцию насыщенной концентрации глюкозы, о чем свидетельствует увеличение скорости их внеклеточного утверждения. В целом, более высокая скорость внеклеточной самоутверждения сигнала от сфероидов, полученных из опухолевых клеток, по сравнению с сигналом от относительно меньших сфероидов, полученных из фибробластов PS1, может быть связана с присущей им метаболической склонностью к гликолизу раковых клеток. В этом репрезентативном митохондриальном стресс-тесте сфероидов опухолевых фибробластов наблюдалось снижение митохондриального дыхания в ответ на ингибитор АТФ-синтазы, что коррелирует с фракцией митохондриального дыхания, используемой для клеточной продукции АТФ.

Вторая инъекция разобщающего агента стимулировала максимальное потребление кислорода сфероидами с соответствующим увеличением митохондриального дыхания. При третьей инъекции первого и третьего комплекса электротранспортной цепи блокируется дыхание митохондрий, наблюдается резкое снижение скорости потребления кислорода. Эти параметры и скорости базального дыхания могут быть использованы для расчета утечки протонов и резервных дыхательных возможностей сфероидов, обеспечивая многопараметрический метаболический анализ намагниченных сфероидов.

После освоения этой техники ее можно выполнить за три-четыре часа, если она хорошо спланирована. Пытаясь выполнить эту процедуру, важно помнить о необходимости гидратации зонда в инкубаторе с температурой 37 градусов за 4-16 часов до проведения метаболического анализа. После процедуры культивирования сфероидов могут быть проведены другие анализы, такие как эксперименты по реакции на дозу, чтобы ответить на дополнительные вопросы об эффективности препарата, токсичности, пенетрантах и восприимчивости.

После своего развития этот метод проложил путь исследователям в области рака поджелудочной железы к изучению взаимодействия стромы опухоли в микроокружении опухоли в трехмерной модели, которая имитирует биологию опухоли in vivo и ее характеристики. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как культивировать трехмерные сфероиды, начиная с культивируемых опухолей поджелудочной железы и клеток фибробластов и заканчивая последующим анализом клеточных метаболических функций.