Анализ фагоцитоза для апоптозных клеток в Drosophila Эмбрионы

Мы здесь описываем анализ фагоцитоза с использованием дисперсных эмбриональных клеток Drosophila . Это позволяет нам легко и точно определять уровни фагоцитоза in vivo и идентифицировать новые молекулы, необходимые для фагоцитоза апоптозных клеток.

Общая цель этой процедуры состоит в том, чтобы измерить in vivo фагоцитоз у дрозофил для оценки участия специфических генов, представляющих интерес, в поглощении апоптотических клеток. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области иммунологии и биологии развития о механизмах, участвующих в поглощении апоптотических клеток. Основное преимущество этой методики заключается в том, что клетки можно легко использовать и точно измерять in vivo уровни фагоцитоза.

Применение этого метода распространяется на терапию воспалительных заболеваний и аутоиммунных заболеваний, поскольку апоптотическая клетка путем фагоцитоза необходима для удаления опасных клеток, вызывающих воспаление. Начните с добавления 200 взрослых самок и 200 взрослых самцов плодовых мушек и тарелку свежего виноградного сока агара на дрожжах в коническую трубку объемом 50 миллилитров. Закройте трубку губчатой крышкой и инкубируйте мух на свету при температуре 16 градусов Цельсия в течение двух-трех дней.

В конце инкубации переместите мух до температуры 25 градусов Цельсия в темноте на один час и замените старую пластину на новую пластину без дрожжей. Дайте мухам отложить яйца в течение двух часов. Затем инкубируйте тарелку при температуре 16 градусов Цельсия в течение 26 часов.

На следующий день с помощью малярной кисти перенесите эмбрионы в один миллилитр PBS с добавлением 0,2% Triton X-100. После двух промывок добавьте к зародышам 1,2 миллилитра раствора гипохлорита натрия для удаления хориона. Через три минуты четыре раза промойте эмбрионы в свежем PBS плюс Triton X-100.

Перенесите промытые эмбрионы на шестисантиметровую агарозную пластину и поместите пластину под препарирующий микроскоп. Определите эмбрионы 16 стадии с помощью микронаконечника. С помощью микропипетки перенесите примерно 50 из 16 эмбрионов стадии в микропробирку объемом 1,5 миллилитров

Чтобы изолировать эмбриональные клетки, сначала дважды промойте эмбрионы 150 микролитрами PBS. Перенесите эмбрионы в новую микропробирку объемом 1,5 миллилитров. Затем добавьте 200 микролитров коллагеназы и гомогенизируйте эмбрионы 30 раз с помощью пеллетного миксера.

В конце гомогенизации растирают эмбриональные клетки 10 раз и переносят клеточную суспензию в новую пробирку объемом 1,5 миллилитра. Инкубируйте клетки при температуре 37 градусов Цельсия в течение одной минуты. Затем растираем клетки еще 10 раз и возвращаем их в инкубатор с температурой 37 градусов Цельсия еще на минуту.

В конце второй инкубации добавьте в клетки 800 микролитров PBS и соберите клетки путем центрифугирования. Повторно суспендируйте гранулу в 200 микролитрах трипсина перед фильтрацией клеточной суспензии через сетчатое фильтр 70 микрон. Остановите ферментативную активность с помощью 40 микролитров тепло инактивированной фетальной бычьей сыворотки в 800 микролитрах PBS и соберите клетки центрифугированием.

Повторно суспендируйте осажденные клетки в 200 микролитрах свежего PBS и соберите клетки с помощью еще одного центрифугирования. Повторно суспендируйте гранулу в 30 микролитрах PBS и установите элементы на стеклянное стекло, покрытое аминопропилтриэтоксисиланом. Когда клетки прикрепятся, с помощью пипетки удалите избыток PBS со предметного стекла и зафиксируйте клетки с помощью от 60 до 70 микролитров 4% параформальдегида.

Через 10 – 15 минут снимите фиксатор и промойте клетки в PBS в течение одной минуты. Чтобы иммуноокрашивать клетки антителами против Крокеморта, сначала последовательно замачивайте предметное стекло в метаноле, затем PBS с добавлением 0,2% Triton X-100, а затем только PBS. Затем блокируйте неспецифическое связывание 20 микролитрами 5% цельной сыворотки свиней в PBS плюс 0,2% Triton X-100 в течение 20 минут при комнатной температуре.

Удалите излишки блокирующего раствора и пометьте клетки 20 микролитрами антикрокемортской антисыворотки при температуре четыре градуса Цельсия на ночь. На следующее утро промойте предметное стекло в PBS плюс Triton X-100 в течение пяти 10-минутных инкубаций. После последней стирки промойте предметное стекло в PBS в течение 10 минут.

Затем пометьте клетки 20 микролитрами меченного щелочной фосфатазой Anti-Rat IgG при комнатной температуре в течение одного часа. В конце инкубации пять раз промойте предметное стекло в PBS плюс Triton X-100, как показано на рисунке, а затем замочите его в буферном растворе на 10 минут. Затем пометьте клетки раствором субстрата фосфатазы и понаблюдайте за клетками под световым микроскопом.

Когда в гранулах гемоцитов появятся сильные фиолетовые сигналы, удалите излишки субстрата и замочите предметное стекло в буфере с добавлением ЭДТА на пять-10 минут. В конце инкубации промойте клетки двумя пятиминутными промывками PBS и обработайте их уравновешивающим буфером в течение 10 минут. После удаления раствора пометьте клетки 20 микролитрами раствора терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазы при температуре 37 градусов Цельсия в течение одного часа.

Затем снимите раствор со стекла и замочите ячейки по 0,5 миллилитра, остановите промывку буфера в 17 миллилитрах воды на 10 минут. Затем промойте клетки тремя пятиминутными промывками PBS и пометьте их 20 микролитрами антидигоксигенинпероксидазы в течение 30 минут при комнатной температуре. В конце инкубации четыре раза промойте клетки в PBS, как показано на рисунке, и замочите предметное стекло в пероксидазном субстрате на 30 секунд, пока апоптотические клетки не станут коричневыми.

Когда будет достигнуто оптимальное окрашивание, замочите предметное стекло в воде, чтобы остановить реакцию пероксидазы. На этих изображениях макрофаги дрозофилы, называемые гемоцитами, были окрашены на маркер гемоцитов Croquemort и на присутствие фагоцитированных апоптотических клеток с помощью TUNEL в дисперсных эмбриональных клетках, как показано выше. Крокеморт-положительные клетки демонстрируют фиолетовый сигнал в мелких гранулах своих клеток, в то время как TUNEL-положительные клетки демонстрируют коричневый сигнал во всех своих телах.

В качестве альтернативы, гемоциты могут быть окрашены антителом против GFP, которое окрашивает весь гемоцит, а не только гранулы. В этом эксперименте было проанализировано соотношение фагоцитозирующих гемоцитов к общему количеству гемоцитов у эмбрионов дикого типа или одиночных мутантных эмбрионов, показав, что фагоцитарный индекс был ниже у обоих одиночных мутантных штаммов, чем у мух дикого типа, в то время как общее количество гемоцитов и апоптотических клеток было сходным, что указывает на потребность мутировавших генов в поглощении апоптотических клеток. Нокдаун РНК-интерференции отдельных генов также снижает фагоцитарный индекс, в то время как общее количество гемоцитов и апоптотических клеток остается сопоставимым, что еще больше подчеркивает участие исследованных рецепторов фагоцитоза в фагоцитозе, опосредованном апоптотическими клетками.

После освоения этой техники ее можно выполнить примерно за 15 часов, если она выполнена правильно. При попытке проведения этой процедуры важно помнить о том, что следует избегать избыточного маркера гемоцитов и окрашивания TUNEL для оптимальной оценки фагоцитарной способности клеток. После этой процедуры может быть проведен анализ фагоцитоза in situ всех эмбрионов дрозофилы, чтобы ответить на дополнительные вопросы о месте поглощения или распределении гемоцитов.

После своего развития этот метод проложил путь исследователям в области иммунологии к изучению механизмов поглощения апоптотических клеток у дрозофил. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как измерить in vivo фагоцитоз у эмбрионов дрозофилы.