4.8: Метаболическое мечение

Метаболическое мечение используется для исследования биохимических преобразований и модификаций, происходящих в клетке. Это достигается за счет использования химических аналогов, которые имитируют структуру природных биомолекул. Клетки используют аналоги в своих эндогенных биохимических процессах, производя соединения, которые мечатся. Метка позволяет включать в себя метки обнаружения и аффинности, которые затем могут быть использованы для выяснения метаболических путей с помощью других биохимических аналитических методов, таких как SDS-PAGE и NMR.

В этом видео представлены концепции метаболического мечения и показаны две общие процедуры. Первая использует изотопное мечение для характеристики фосфорилирования белка. Также представлены три применения метаболического мечения: мечение растительного материала, мечение РНК для измерения кинетики и мечение гликанов у развивающихся эмбрионов.

Метаболическое мечение используется для исследования механизмов работы клетки. Это достигается с помощью химических аналогов для исследования происходящих биохимических преобразований и модификаций. В этом видео будут показаны принципы метаболического мечения, типичные процедуры изотопного и фотореактивного мечения, а также некоторые области применения.

Метаболическое мечение может проводиться с использованием ряда стратегий. Здесь мы опишем изотопное, фотореактивное и биоортогональное мечение.

Изотопное мечение осуществляется с помощью структурных аналогов, которые химически идентичны своим природным аналогам, но имеют в свою структуру необычные изотопы. В этом аналоге L-лизина атомы углерода и азота заменены на углерод-13 и азот-15. Клетки, культивируемые в присутствии изотопных аналогов, будут включать их в свои биохимические структуры. Метаболиты собираются из клеток и очищаются для анализа. Образцы со стабильными изотопами анализируются с помощью таких методов, как масс-спектрометрия или ЯМР-спектроскопия. Образцы с радиоактивными метками анализируются с помощью жидкостного сцинтилляционного подсчета и рентгеновских пленок, что будет продемонстрировано в протоколе изотопного мечения.

Фотореактивные метки представляют собой функциональные группы, входящие в состав белков, которые стабильны до воздействия ультрафиолетового света. Функциональная группа образует реакционноспособный радикал, который связывается с ближайшим белком. Распространенный пример, L-фотолейцин, содержит диазириновое кольцо, которое является фотореактивным сшивающим агентом. В отличие от изотопного мечения, существует некоторое химическое различие между фотореактивными химическими аналогами и их природными аналогами. В состав клеток могут отдаваться предпочтение природным соединениям, а не аналогам. Поэтому важно проводить фотореактивное мечение в среде, свободной от имитируемого соединения. Под воздействием ультрафиолетового излучения фотореактивные группы в меченом белке становятся нестабильными и высокореактивными, что приводит к его сшиванию с взаимодействующими белками, создавая белковый комплекс. Сшитые комплексы выступают в качестве моментальных снимков, которые затем могут быть проанализированы с помощью SDS-PAGE и методов масс-спектрометрии. Это дает представление о том, какие реакции происходят в метаболическом пути, путем идентификации видов реакций и их взаимодействия путем определения мест связывания.

В стратегиях биоортогонального мечения используются аналоги с небольшими функциональными группами, которые практически не имеют реакционной способности с природными биомолекулами. Например, азиды представляют собой небольшие функциональные группы, реакционная способность которых ортогональна биохимическим реакциям. При лигировании по методу Штаудингера фосфинная группа атакует группу азидо. Это приводит к переходному состоянию, которое внутримолекулярно реагирует с соседним эфиром, в результате чего образуется лиганд, связанный с амином. Биоортогональные функциональные группы, включенные в биомолекулы, могут быть лигированы с помощью детектирующих меток, таких как флуоресцентные функциональные группы, и аффинных меток, таких как антигены.

Теперь, когда мы обсудили некоторые концепции и стратегии метаболического мечения, давайте посмотрим на процесс в лаборатории.

Первым шагом в эксперименте по метаболическому мечению является сбор интересующего белка. Для этого клетки выращиваются на тарелке, а метод экспрессии используется для стимулирования синтеза нужного белка. В этом примере экспрессируются богатые лейцином повторные киназы, или LRRK. В качестве аналога используется динатрийфосфат, содержащий радиоактивный фосфор-32. Необходимо принять надлежащие меры для защиты от ионизирующего излучения. Это включает в себя обустройство рабочей зоны, ношение надлежащих защитных средств и проверку на радиоактивное загрязнение. После принятия мер безопасности подготавливается среда, содержащая изотопные аналоги. Среду из культуры удаляют и заменяют средой, содержащей изотопные химические аналоги, а затем инкубируют. После инкубации клетки лизируются. Лизат собирается и очищается.

После очистки белки растворяются с помощью SDS-PAGE, а затем переносятся на мембрану PVDF. Авторадиография проводится путем воздействия на мембрану рентгеновской пленки и измеряется с помощью люминофорного тепловизора. Вестерн-блоттинг используется для измерения относительных уровней белка в мембране PVDF. В этом примере были измерены уровни фосфорилирования богатых лейцином повторкиназ, синтезированных в клетках 293T. Авторадиограмма показывает, сколько фосфора было включено в белок. Вестерн-блоттинг выясняет уровни белков LRRK. Программное обеспечение для анализа изображений используется для получения количественных данных об уровнях фосфорилирования белков.

В этой следующей процедуре демонстрируется фотореактивная маркировка. Сначала клетки подготавливаются и культивируются. Фотореактивный аналог добавляется в клетки в середине логарифмической фазы и инкубируется. В этой процедуре используется п-бензоилфенилаланин. Образцы отбирают через определенные промежутки времени и кладут на лед. Затем образцы подвергаются воздействию для получения снимков биохимических путей с течением времени. Затем представляющие интерес белки очищают и разрешают с помощью SDS-PAGE.

Для идентификации соединений, взаимодействующих с интересующим белком, была использована стратегия фотореактивного мечения. Иммунодетектирование с помощью вестерн-блоттинга показывает белковые полосы, которые указывают на присутствие белков с более высокой молекулярной массой в облученных образцах. Они возникают в результате сшивки из-за взаимодействия белок-белок, происходящего во время ультрафиолетового облучения.

Теперь, когда мы рассмотрели процедуры метаболического мечения, давайте рассмотрим некоторые способы использования этого процесса.

Концепции метаболической маркировки могут быть распространены на многоклеточные организмы. Растения выращиваются в закрытой среде, богатой стабильными изотопами для производимого маркированного растительного материала. В вольер добавляется углекислый газ, содержащий углерод-13, при этом используется удобрение, богатое азотом-15. Полученный в результате собранный растительный материал может помочь ответить на вопросы о круговороте углерода и азота в экосистеме.

Мечение позволяет отделить вновь синтезированную РНК от более старой РНК. Изменяя начальную концентрацию аналога, можно определить кинетику синтеза новой РНК. Результаты показывают, что концентрация 4-тиуридина влияет на то, сколько новой РНК транскрибируется. Кроме того, скорость включения метки в РНК может быть непосредственно количественно определена с помощью спектрофотометра.

Используя биортогональную клик-химию, гликаны в эмбрионе рыбы данио могут быть помечены. Яйцам вводят меченочное соединение, в результате чего на гликанах образуются алкиновые метки. Затем гликаны в личинках личинки лигируются до соединения красителя на желаемой стадии развития. Затем визуализируются гликаны в эмбрионах. Гликаны, произведенные в разные моменты времени, могут быть идентифицированы путем маркировки разными цветами на разных этапах развития эмбриона.

Вы только что посмотрели видео JoVE о метаболической маркировке. В этом видео описываются концепции, лежащие в основе метаболического мечения, и их стратегии, рассматриваются две общие процедуры и рассматриваются некоторые способы использования этих методов.

Спасибо за просмотр!