Радионуклида флуоресценции Репортер ген Imaging для отслеживания опухолевой прогрессии в моделях грызунов опухоли

Общая цель этого протокола — отслеживать рост опухоли и метастазирование у живых грызунов с помощью визуализации. Радионуклидфлуоресцентный термоядерный репортер позволяет неинвазивно обнаруживать in vivo с помощью позитронно-эмиссионной томографии, при этом флуорофор помогает подтвердить результаты ex vivo. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы, когда необходимо отслеживать клетки у живых животных в течение длительного периода времени.

Это может способствовать пониманию отдаленных метастазов и влияния лечения на прогрессирование опухоли. Описанный метод представляет собой отслеживание раковых клеток с помощью высокочувствительной и неинвазивной визуализации in vivo с помощью ПЭТ-индикатора, полученного методом автоматизированного синтеза. Это обеспечивает значительное сокращение использования животных по сравнению с традиционной методологией.

Люди, плохо знакомые с этим методом, могут быть ошеломлены его сложностью. В частности, автоматизированный синтез радиоактивного индикатора ПЭТ значительно упрощает этот процесс. Мы полагаем, что визуальная демонстрация этого метода демонстрирует эти взгляды на критические этапы, связанные с визуализацией.

Применение этого метода распространяется на доклинические испытания новых терапевтических средств, которые также могут быть отслежены наряду с раковыми клетками. Этот метод может дать представление о биологии рака и разработке методов лечения. Во всех случаях интерес представляет локализация, перемещение, расширение и долгосрочный мониторинг определенной популяции in vivo.

Для начала используйте плазмиды репортерных генов, сгенерируйте частицы лентивируса, трансдуцируйте клетки и охарактеризуйте их. Затем проанализируйте функцию репортерного гена путем поглощения радиоактивными индикаторами в клеточных линиях, экспрессирующих NISFP. Засейте очищенные клетки и питательную среду в шесть луночных планшетов, следя за тем, чтобы все образцы были приготовлены в трех экземплярах.

На следующее утро промойте клетки питательной средой, свободной от сыворотки, и инкубируйте планшеты с 50 килограммовыми беккерелями тетрафторбората F18 при температуре 37 градусов Цельсия в течение 30 минут. Затем соберите надосадочную жидкость и переложите 100 микролитров в заранее размеченную пробирку для сбора. Выбросьте оставшуюся надосадочную жидкость, затем промойте клетки одним миллилитром ледяного ПВС, содержащего кальций и магний на физиологическом уровне.

Соберите раствор для промывки и перелейте 100 микролитров раствора для промывки в предварительно маркированную пробирку для сбора. Затем повторите процесс стирки еще раз. Добавьте 500 микролитров ПВС, содержащего как трипсин, так и ЭДТА, чтобы поднять клетки.

Инкубируйте образцы при температуре 37 градусов Цельсия до тех пор, пока клетки не отделятся, используя микроскоп для проверки на отслойку. Затем перенесите клеточную суспензию в пробирку для сбора с маркировкой. Затем центрифугируйте образцы клеток при 250 G в течение четырех минут при четырех градусах Цельсия.

Используйте автоматический гамма-счетчик для подсчета образцов из каждого из четырех типов образцов и получения процента поглощения с помощью уравнения один. Чтобы начать синтез тетрафторбората F18, настройте автоматизированную платформу радиосинтеза в соответствующем химическом колпаке и убедитесь, что на управляющий компьютер загружен правильный XML-файл. Пока синтезатор работает, будет производиться тетрафуороборат F18, который затем очищаться на анионном обменном картридже.

Анионообменный картридж будет промыт водой, а затем высушен газообразным азотом. Конечный продукт отбирается из анионообменного картриджа с одним миллилитром 0,9% хлорида натрия и через выпускную линию подается в стеклянный флакон для сбора. Чтобы начать визуализацию, сделайте анестезию и подготовьте мышей согласно написанному протоколу.

Затем с помощью стерильного 0,9%-ного физиологического раствора разбавить раствор тетрафторбората F18 до 5 мегабеккерелей на 50 микролитров. С помощью шприца с иглой для подкожных инъекций набрать 100 микролитров раствора тетрафторбората F18. Измерьте радиоактивность в шприце и запишите значение и время измерения.

Введите 50 микролитров раствора тетрафторбората F18 в предварительно подогретый хвост внутривенно. Затем измерьте оставшуюся радиоактивность в шприце и запишите значение и время измерения. Введение радиоактивного индикатора в хвостовую вену имеет решающее значение.

Мы проводим его под анестезией животных, чтобы свести к минимуму риск неправильной инъекции и утечки радиоактивного индикатора. Животное остается под наркозом до начала получения ПЭТ-изображения. Ровно через 45 минут после введения радиоиндикатора.

Затем установите таймер для обратного отсчета от 45 минут и убедитесь, что мышь расположена на столе в грудном положении. Установите соответствующие инструменты для хирургического мониторинга и убедитесь, что инструменты функционируют должным образом, прежде чем двигаться дальше. Затем установите перометры для компьютерной томографии и получения изображений ПЭТ.

Когда таймер обратного отсчета показывает 15 минут, начинается получение КТ-изображения, а когда таймер показывает ноль минут, начинается получение ПЭТ-изображения. Сначала измерьте радиоактивность всей усыпленной мыши и запишите значение и время измерения. Затем препарируйте мышей и соберите необходимые ткани.

Измерьте радиоактивность оставшейся туши с хвостом и без него. Запишите эти значения и отметьте время измерения. Затем взвесьте все собранные ткани по отдельности и сфотографируйте раковые органы при дневном свете и при флуоресцентном свете.

Затем встройте ткани в ОКТ для последующей гистологии. Измерьте радиоактивность всех собранных тканей, запишите значение и отметьте время измерения. Наконец, представьте данные в виде стандартных значений поглощения или внедорожника, как описано во втором уравнении.

В этом эксперименте была использована визуализация генов радионуклидного флуоресцентного регистратора для отслеживания прогрессии опухоли в модели опухоли грызунов. Конфокальная флуоресцентная микроскопия продемонстрировала точную локализацию NISFP на плазматической мембране. Функцию и специфичность NISFP количественно оценивали с использованием NIS, обеспечивающего поглощение радиоиндикаторов.

Существенных различий между 4T1NISGFP и 4T1NISRFP экспрессирующими клеточными линиями со сходными уровнями экспрессии NIS не отмечено. Важно отметить, что прехлоратный блок продемонстрировал во всех клеточных линиях, что полученное поглощение радиофармпрепарата обусловлено специфической экспрессией NISFP. TПЭТ-визуализация всего тела у животных с опухолями позволила получить информацию о прогрессировании опухоли и метастатическом распространении.

Показанный здесь пример показывает обширные длинные метастазы с несколькими отчетливыми узелками в легком. Проценты вводимых доз и занимаемые объемы отдельных метастазов в легкие варьировали. Тем не менее, нормализованные по объему проценты вводимой дозы находились в аналогичном диапазоне.

Флуоресцентный белок в гене репортера с двойным режимом позволил идентифицировать раковую ткань под светом флуоресценции во время вскрытия животных. Последующее биораспределение радиофармузоров ex vivo выявило органы с высоким поглощением радиоактивных индикаторов и, таким образом, ткани, экспрессирующие NIS. В то время как щитовидная железа и слюнные железы, а также желудок самостоятельно экспрессируют ННГ, все остальные положительные сигналы указывают на раковые ткани, такие как опухоль и метастазы.

Радионуклидный флуоресцентный репортер также позволяет идентифицировать раковые клетки в последующих срезах тканей. Этот метод проложил путь исследователям в области рака, чтобы визуализировать процесс спонтанного метастазирования и проверить, как лекарства влияют на него. Пытаясь выполнить эту процедуру, важно тщательно спланировать все шаги вперед.

Должны быть созданы клеточные линии, созданы модели опухолей животных, а все реагенты и оборудование для визуализации должны быть доступны в нужный день. Для начала мы рекомендуем проводить небольшие пилотные эксперименты. После освоения производство радиоиндикаторов и визуализация животных in vivo могут быть выполнены с шестью животными в течение восьмичасового рабочего дня, если это выполнено правильно.

После просмотра этого видео вы должны иметь хорошее представление о том, как подойти к репортерному гену, доступному для отслеживания клеток in vivo, с помощью радионуклидного репортера NIS в сочетании с флуоресцентным белком. Вы также должны быть в состоянии охарактеризовать репортерные клеточные линии NISFP для получения необходимого радиоиндикатора ПЭТ для визуализации in vivo и для проведения экспериментов in vivo и ex vivo путем распределения. После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как флюороцитометрия, чтобы ответить на дополнительные вопросы.

Например, как профиль иммунных клеток опухоли и ее метастазирование соотносятся друг с другом или изменяются с течением времени. Не забывайте следить за тем, чтобы в производимых вами клеточных линиях не содержались микроплазмиды, так как последние влияют на исход. Важно не забывать, что работа с радиоизотопами может быть чрезвычайно опасной и защита себя и окружающих всегда должна быть приоритетной при выполнении этой процедуры.