Мелких животных модель Ex Vivo нормотермических печени перфузии

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области трансплантации и сохранения органов. Применение этого метода включает в себя тестирование новых перфузатов и перфузатных добавок, тестирование программного обеспечения, предназначенного для оценки органов, и проведение экспериментов, предназначенных для восстановления органов. Основное преимущество этой методики заключается в том, что представленная здесь модель нормотермической перфузии печени ex vivo проста, легко воспроизводима, недорога и имеет широкий спектр применения.

Начните с подготовки портальной манжеты 16 калибра. Отрежьте пятимиллиметровый участок трубки, а середину сечения определите, измерив 2,5 миллиметра. Надрежьте в средней точке и удалите переднюю половину трубки.

С помощью гемостата измельчите эту теперь уже плоскую часть. Используйте зажигалку, чтобы расплавить другой конец ангиокатетера, чтобы получилась губа. Далее подготовьте канюлю желчного протока, вырезав инъекционный порт из ангиокатетера 27 калибра, оставив только катетер.

Подсоедините его к 10-сантиметровому участку трубки канюли 27 калибра. Поместите крысу под наркозом так, чтобы ее нос находился в носовом конусе для анестезии, а четыре ее конечности были обездвижены. Следите за жизненными показателями, приложив монитор к левой задней конечности.

Выполните щипнение пальцев ног, чтобы подтвердить подходящую глубину анестезии. Опрыскайте брюшную полость животного 70%-ным изопропиловым спиртом и дайте ему высохнуть. Наденьте на животное стерильную простыню.

Затем, сделав разрез по средней линии от мечевидной кости к лобку с помощью острых ножниц, аккуратно войдите в брюшину и надрежьте мышцу. Разрез следует расширить в боковом направлении влево и вправо, чтобы образовался крест на уровне нижней границы печени. На этом этапе уменьшите дозу изофлурана до 2%Втяните мечевидный отросток с помощью изогнутого противомоскитного зажима, а ребра — с помощью реберных ретракторов.

Затем острыми ножницами разрежьте серповидные, френовые и желудочно-печеночные связки. Найдите и перевяжите диафрагмальную вену швом 7-0 как можно ближе к ее началу, чтобы предотвратить подтекание. Затем используйте стерильный смоченный ватный аппликатор, чтобы выпотрошить крысу.

Оберните кишечник марлей, смоченной 0,9% физиологическим раствором, стараясь не растягивать сосудистую сеть. Затем рассеките над нижней полой веной, чтобы удалить лишнюю ткань. Рассеките позади НПВ чуть выше разветвления и пропустите петлю шелкового шовного материала 4-O для последующего использования.

Затем втяните правую почку, чтобы обеспечить доступ к правой вене надпочечника, и втяните правую долю печени сверху с помощью марли. Перевяжите правую вену надпочечника шелковым швом 7-0 как можно ближе к IVC и прижгите ее дистальнее завязки. Затем тщательно рассекаем селезеночную вену.

Завяжите с помощью двух шелковых швов 7-0 и разрежьте его между двумя швами. После рассечения вокруг гастродуоденальной артерии перевяжите гастродуоденальную артерию шелковым швом 7-0 и перевязайте. Затем рассеките вокруг печеночной артерии и свободно наложите на нее шелковую шовную завязку 7-0.

Далее рассекаем желчный проток. Затем проверьте длину желчного протока, перевяжите его на дистальном конце и наложите петлю из шва вокруг желчного протока и проксимально насколько это возможно. С помощью маленьких ножниц вырежьте отверстие, которое составляет половину диаметра протока, и поместите катетер 27 калибра в желчный проток проксимально.

Завяжите катетер на месте с помощью римского шва для сандалий. Затем с помощью иглы 27 калибра введите 0,5 миллилитра гепарина в вену полового члена, или НПВ. Затем зажмите и перевяжите НПВ с помощью ранее наложенного шелкового шва 4-0 и перевяжите печеночную артерию с помощью ранее установленного шелкового шва 7-0.

Теперь используйте микрохирургический зажим, чтобы зажать воротную вену. Канюлируйте воротную вену с помощью ангиокатетера 22 калибра и промойте 60 миллилитрами холодного 0,9% физиологического раствора, содержащего 100 единиц гепарина, пока печень не побледнеет. После промывания печени обнажите надпеченочный НПВ и разрежьте его как можно выше в грудной клетке.

Выполняйте гепатэктомию, разрезая вокруг диафрагмы, а затем разрезая печеночную артерию, НПВ, воротную вену и любые дополнительные связки. Выньте печень и поместите ледяной 0,9% физиологический раствор. Наконец, поместите сосудистую манжету 16 калибра в воротную вену и подключите печень к контуру первичной перфузии печени ex vivo.

Перед началом каждой перфузии следует проводить визуальный осмотр контура для выявления повреждений или наростов на компонентах контура или трубках. Если в цепи скопились бактерии или другие вещества, детали следует заменить или очистить. Начните с подачи перфузата со скоростью два миллилитра в минуту.

Следите за монитором на предмет скачков давления в воротной вене, так как это может указывать на окклюзию сосуда и потребовать изменения положения канюли. Вставьте канюлю протальной вены в воротную вену с манжетой для обратного потока перфузата и наложите шов с помощью шелкового шва 7-0. Как только обе канюли будут на месте, начните увеличивать поток перфузата на один миллилитр в минуту до тех пор, пока не будет достигнуто физиологическое давление в диапазоне от 10 до 16 сантиметров воды.

Во время перфузии удалите по одному миллилитру образцов из предварительного и постпорта. Разделите каждый образец объемом один миллилитр на два образца объемом 0,5 миллилитров. Мгновенно заморозьте одну из 0,5 миллилитров аликвот в криогенных пробирках в жидком азоте и проведите анализ газов артериальной крови, используя оставшиеся 0,5 миллилитров перфузата.

Затем измерьте pH и при необходимости буферизуйте перфузат, чтобы вернуться к pH 7,4. После четырех часов перфузии отключите печень от контура перфузии. Разделите печень на сегменты по 0,5 грамма, переложите в криогенные пробирки и заморозьте в жидком азоте.

АЛТ измеряли при нуле, 30, 60, 90, 120, 150, 180, 210 и 240 минутах перфузии. Значительно меньше АЛТ в группе базового перфузата плюс PEG-CAT по сравнению с базовым перфузатом, который отображается черным цветом через 150, 180, 210 и 240 минут. АТФ в тканях поддерживали в группе перфузата основания плюс PEG-CAT по сравнению с группой только перфузата оснований.

Продукция MDA в тканях была значительно выше в группе базового перфузата, чем в группе базового перфузата плюс PEG-CAT. Общий GSH поддерживался в базовом перфузате плюс PEG-CAT по сравнению с группой только базового перфузата. Каждое предлагаемое применение нормотермической перфузии печени ex vivo должно быть методически протестировано на животных моделях перед тестированием на выброшенных человеческих органах, а затем на печени человека.

Представленная здесь модель идеальна, так как легко воспроизводима, исключает лишние тесты и отличается низкой стоимостью. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как выполнить недорогую, легко воспроизводимую, нормотермическую модель перфузии печени ex vivo с использованием крыс.