Моделирование остеосаркома, используя синдром ли Фраумени, которую пациент производные индуцированных плюрипотентных стволовых клеток

Эта модель остеосаркомы на основе iPSC синдрома Ли-Фраумени может помочь ответить на ключевые вопросы в области исследований остеосаркомы об использовании iP-клеток пациента в моделировании рака. Основное преимущество этой модели заключается в том, что она позволяет генерировать неограниченное количество клеток на всех этапах развития остеосаркомы для механистических исследований, идентификации биомаркеров и скрининга лекарств. Руоцзи будет демонстрировать процедуру культивирования клеток, а я продемонстрирую процедуру на животных.

После двух недель мышиного эмбрионального фибробласта, или MEF, кокультура промывает культуру клеток от 80 до 90% слитых iPS пятью миллилитрами DPBS с последующим добавлением одного миллилитра раствора для отделения клеток в клетки для трехминутной инкубации при комнатной температуре. Крайне важно поддерживать iPS-клетки в хороших условиях на MEF в течение как минимум 14 дней, чтобы клетки могли прикрепляться к пластине, покрытой желатином, для их дифференцировки в мезенхимальные стволовые клетки. Когда клетки отделились от дна планшета, добавьте к клеткам девять миллилитров питательной среды MEF/MSC для нейтрализации раствора для отслоения клеток и перенесите клеточную суспензию в 100-миллиметровый планшет для культуры тканей без покрытия.

Инкубируйте клетки при комнатной температуре в течение 30 минут, чтобы позволить MEF прикрепиться к планшету, и тщательно соберите неприкрепленный надсадочный сад, содержащий клетки iPS. Центрифугируйте раствор iPS-клеток и ресуспендируйте гранулу в шести миллилитрах среды для дифференцировки MSE. Затем засейте по два миллилитра клеток в каждую из трех лунок, покрытых 0,1% желатином, шестилуночного планшета и поместите планшет в инкубатор для клеточных культур на 28 дней, подкармливая клетки свежей средой каждые два дня для удаления любых неприкрепленных или мертвых клеток.

На 28-й день будут видны большие массы дифференцированных клеток с фибробластоподобными МСК, наблюдаемыми по краям кластеров. Промойте клеточные культуры одним миллилитром DPBS на лунку с последующим их отделением 0,5 миллилитрами 0,25%Трипсин-ЭДТА на лунку при комнатной температуре. Через три минуты нейтрализуйте тирипсин с помощью 1,5 миллилитров питательной среды MEF/MSE на лунку и объедините отделенные MSE в одну коническую пробирку объемом 15 миллилитров для их центрифугирования.

Ресуспендируйте гранулу в трех миллилитрах питательной среды MEF/MSE и высадите клетки на 60-миллиметровую пластину, покрытую желатином толщиной 0,1%, меняя среду каждые два дня до тех пор, пока клетки не достигнут 100% слияния. После расщепления 100% конфлюентной культуры в соотношении один к трем, МСК будут быстро пролиферировать, демонстрируя фибробластоподобную морфологию и формируя завихреобразный рисунок культуры, когда культура достигает высокой плотности. МСК, полученные из iPS-клеток, также могут быть исследованы с помощью иммунофлуоресцентного окрашивания на наличие маркеров мезенхимальных стволовых клеток в любой момент их дифференцировки.

Для дифференцировки МСЭ в остеобласты наносят соответствующее количество МГЭ из 95% сливающейся клеточной культуры на планшет для клеточной культуры в соответствующем объеме культуральной среды MEF/MSC в течение 24 часов. Затем начинают заменять надосадочную жидкость соответствующим объемом среды для дифференцировки остеобластов на следующий день и каждые два дня после этого до окончания периода культивирования. Для выявления костноассоциированной щелочной фосфатазы, продуцируемой преостеобластами, и минерального осаждения, продуцируемого зрелыми остеобластами, проводят окрашивание щелочной фосфатазой и Ализарин Ред S соответственно в соответствии с протоколом производителя в соответствующие экспериментальные моменты времени.

Создать модель онкогенеза in vivo с помощью дифференцированных остеобластов засеять соответствующее количество МСК в пяти 100-миллиметровых чашках, чтобы начать остеобластическую дифференцировку. На 14-е сутки остеобластической дифференцировки пять культуральных планшетов остеобластов промыть пятью миллилитрами ДПБС и обработать клетки 1,5 мл раствора для отделения остеобластов на чашку. После 30-минутной инкубации при 37 градусах Цельсия подтвердить отслойку клеток с помощью световой микроскопии и нейтрализовать раствор отслойки свежей средой для дифференцировки остеобластов.

Объедините клетки в коническую пробирку объемом 50 миллилитров для их центрифугирования и повторно суспендируйте гранулу в 25 миллилитрах свежей среды для дифференцировки остеобластов. Отфильтруйте клеточный раствор через ситечко 70 микрон, чтобы удалить все агрегированные клетки перед подсчетом, и отложите от 1 X 10 до 7 клеток для подкожной инъекции. Гранулируйте клетки центрифугированием и восстановите клетки в соотношении от 1 X 10 до 7 остеобластов на 50 микролитров ледяной концентрации DPBS.

Смешайте остеобласты с равным объемом фенольно-красной свободной матрицы базальной мембраны и поместите клетки на лед до их инъекции. После подтверждения отсутствия реакции на защемление пальца ноги у восьминедельной самки голой мыши с ослабленным иммунитетом загрузите клетки в одномиллилитровый шприц, оснащенный иглой 27 калибра, и подкожно введите 100 микролитров клеток в продезинфицированный бок животного. Затем наблюдайте за мышами с еженедельным сердцебиением в месте инъекции на предмет роста подкожных узловых плотностей.

Образование опухоли должно наблюдаться в период от шести до 10 недель после инъекции. Созданные клоны iPS-клеток LFS должны демонстрировать типичную для человека эмбриональную морфологию стволовых клеток и демонстрировать положительную активность щелочной фосфатазы. iPS-клетки LFS также высоко экспрессируют мРНК фактора плюрипотентности, сравнимые с линиями эмбриональных стволовых клеток человека и значительно превышающие уровни, наблюдаемые в родительских фибробластах.

Успешно дифференцированные МСК СЛК также экспрессируют типичные маркеры МСК, включая CD44, CD73, CD105 и CD166, что оценивается с помощью иммунофлуоресцентного окрашивания. Когда МСК подвергаются остеогенным сигналам дифференцировки, дифференцированные клетки начинают проявлять положительную активность щелочной фосфатазы к девятому дню и отложение минералов к 21-му дню. Дифференцирующие остеобласты также демонстрируют повышенную экспрессию генов преостеобластов и зрелых остеобластов на протяжении всего процесса их дифференцировки.

Через 6-10 недель после инъекции остеобластов опухоли, полученные из остеобластов LFS, демонстрируют незрелые характеристики остеобластов, включая положительную активность щелочной фосфатазы, положительное отложение коллагенового матрикса и отрицательную минерализацию. После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как дифференцировать iPS-клетки синдрома Ли-Фраумени в остеобласты и создать модель остеосаркомы in vivo с использованием остеобластов, полученных от пациента. В дополнение к остеосаркоме, эта модель заболевания на основе iPS-клеток синдрома Ли-Фраумени также может быть применена к другим злокачественным новообразованиям, связанным с синдромом Ли-Фраумени, таким как саркома мягких тканей, рак молочной железы и опухоли головного мозга.