Метаболический Анализ Drosophila melanogaster Larval и взрослых мозги

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы о метаболизме мозга дрозофилы и о том, как чрезмерная пролиферация глиальных клеток влияет на метаболическое перепрограммирование, будь то диета или поведение изменяют метаболизм. Основное преимущество этого метода заключается в том, что мозг мухи может быть метаболически проанализирован как одна целая неповрежденная ткань с воспроизводимыми результатами, полученными при измерении только одного мозга за раз. Хотя этот метод может дать представление о метаболизме мозга мухи, он также может быть применен к другим тканям и модельным системам, таким как имагинальные диски и C.elegans, соответственно.

Чтобы подготовить микротканевые ограничители, выберите из контейнера для хранения один микротканевый ограничитель для каждого измеряемого мозга, а также не менее трех для использования в качестве ограничительного контроля. Используя сетчатую корзину и шестилуночную пластину, промойте ограничители семидесятипроцентным этанолом и промойте их деионизированной водой три раза, каждый раз в течение двух минут. Проведите дополнительные водные промывки, если ограничители все еще источают запах спирта.

Промойте микротканевые ограничители в пробирной среде и оставьте их в растворе до тех пор, пока они не будут готовы к использованию. Чтобы препарировать мозг личинки Drosophila melanogaster, выберите личинки конца третьего возраста из флакона с культивированными мухами Organ R. Поместите личинку в лунку чистой препарирующей точечной пластины, содержащей 500 микролитров 1x PBS.

Далее промойте личинку, аккуратно встряхнув ее в лунке и переложите в другой чистый колодец. Затем поместите точечную пластину под препарирующий микроскоп. Возьмитесь за личинку в средней части одним пинцетом, а за крючки для глаз возьмитесь вторым пинцетом.

Аккуратно и плавно потяните личинку в противоположных направлениях с помощью двух наборов пинцета. Представьте себе мозг, который обычно остается прикрепленным к глазным крючкам и обычно имеет прикрепленные к нему диски глазных антенн. С помощью крючков для глаз удерживают мозг на месте, аккуратно удаляют дополнительные ткани.

Наконец, отделите крючки для глаз от мозга. Затем с помощью пинцета перенесите расчлененный мозг в новую лунку, содержащую 1x PBS. Чтобы добавить препарированный мозг в 96-луночный метаболический планшет, сначала добавьте 50 микролитров пробирной среды во все лунки, включая экспериментальную, контрольную, ограничительную и фоновую лунки.

Затем осторожно поместите по одному мозгу в каждую лунку. Под микроскопом для препарирования с помощью микрозонда с изогнутой иглой прижмите мозг к дну лунки. Аккуратно расположите мозги в центре трех приподнятых сфер с помощью зонда.

Чтобы добавить микротканевый ограничитель к 96-луночному метаболическому анализирующему планшету, сначала поместите его на край. Под микроскопом сориентируйте его пластиковым кольцом вниз и сеткой сверху. Далее извлеките пластину из микроскопа.

С помощью пинцета обхватите удерживающее устройство с обеих сторон и осторожно опустите его в лунку. С помощью микрозонда с изогнутой иглой вдавите ограничитель в лунку. Микротканевые ограничители должны быть правильно расположены над центрированным мозгом в каждой лунке, чтобы этот метод дал значимые результаты.

Под микроскопом убедитесь, что расчлененный мозг можно увидеть через тканевый ограничитель и что он центрирован в лунке, и повторите процедуру для всех лунок, которые будут использоваться в анализе. Осторожно добавьте по 130 микролитров пробирной среды в каждую из экспериментальных, контрольных и удерживающих лунок. Убедитесь, что мозг и микроткани не сдвинулись во время добавления среды.

Затем добавьте 180 микролитров пробирной среды в четыре угловые лунки для использования в качестве фонового контроля. При этой процедуре снимают подсобную пластину и добавляют клеточную пластину без крышки в той же ориентации к метаболическому анализатору. Select Load Cell Plate", чтобы прибор принял пластину с ячейкой, закрыл лоток, а затем начал анализ.

Когда анализ будет завершен, извлеките выброшенную клеточную пластину и картридж. Используя препарирующий микроскоп, убедитесь, что мозг и микротканевые ограничения все еще правильно расположены в лунке после завершения анализа, и исключите из анализа любые лунки с аномалиями. При соблюдении оптимизированных условий анализы с участием личинок и мозга взрослой особи приводят к тому, что показания OCR немного превышают 150 пикомолев в минуту в стабилизированной шестой временной точке, примерно через 25 минут после начала анализа.

Этот темп поддерживается от 30 минут до двух часов. В шестой временной точке ECAR немного ниже, чем в мозге личинок в шестой временной точке, и поддерживается в течение не менее 30 минут. Это открытие соответствует увеличению гликолиза на личиночных стадиях для поддержания роста.

Инъекция митохондриального ингибитора, такого как олигомицин, снижает показания OCR, чтобы выявить АТФ-зависимое дыхание, а дальнейшее лечение ротеноном и антимицином А снижает OCR, чтобы выявить немитохондриальное потребление кислорода. Пытаясь выполнить эту процедуру, важно помнить о необходимости центрирования мозга и обеспечения фиксации микротканей на месте перед проведением анализа и во время анализа. После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как количественная ПЦР и вестерн-блоттинг, чтобы ответить на дополнительные вопросы о том, как экспрессия генов влияет на наблюдаемый метаболический фенотип.