Следственный млекопитающих Axon регенерации: В Vivo электропорации взрослых мыши Спинной корень ганглия

Электропорация является эффективным подходом для доставки генов интересов в клетки. Применяя этот подход в естественных условиях на нейроны взрослых мыши корневой спинной ганглий (DRG), мы описываем модель для изучения регенерации аксона в естественных условиях.

Этот метод обеспечивает технику трансфекции генов in-vivo для манипулирования экспрессией генов в сенсорных нейронах взрослых мышей для будущих исследований экзорегенерации млекопитающих. Основное преимущество этой методики заключается в том, что она менее трудоемка и занимает меньше времени, а также может как сверхэкспрессировать, так и сбивать гены-мишени одновременно и по отдельности. Чтобы начать эту процедуру, отметьте мелким маркером обе стороны гребня подвздошной кости мыши, находящейся под наркозом.

Проведите линию, соединяющую две точки гребня подвздошной кости, чтобы облегчить идентификацию позиций ДРГ L5. Затем сделайте микроножницами трехсантиметровый разрез по средней линии поясницы. После этого отделите параостистые мышцы, такие как многораздельная мускулатура и длинная поясничная мышца, от остистых отростков L3 до S1 и обнажите фасциальный сустав L4-5 и L5-6.

Затем с помощью микро ронжера удалите фасциальные стыки L4-5 и L5-6. Впоследствии удалите левую нервную дугу L4 и L5, чтобы обнажить дорсальную сторону ДРГ. Для инъекции DRG загрузите плазмиды ДНК или олигоны РНК в стеклянную капиллярную пипетку.

Затем осторожно введите кончик пипетки из капиллярного стекла в DRG и постепенно вводите один микролитр раствора ДНК-плазмид или олигонотидов РНК с помощью системы внутриклеточного дозирования микроинъекций. Для электропорации аккуратно сожмите целевую DRG электродами и подайте пять квадратных электрических импульсов с помощью системы электропорации. Впоследствии закройте мышцу, затем кожу слоями капроновыми нитями.

Через два-три дня после электропорации DRG обезболите мышь внутрибрюшинно, прикрепите ее конечности к пробковой доске и сделайте разрез в один сантиметр на 0,5 сантиметра в левую сторону по средней линии. Затем разрежьте мышцы, такие как большая ягодичная мышца и грушевидная мышца, в продольном направлении. Затем обнажите сегмент седалищного нерва между большим седалищным отверстием и седалищной выемкой.

Раздавите нерв микрохирургическими щипцами в течение 12 секунд и отметьте место раздавливания нейлоновым эпиневральным швом. После этого закройте мышечные и кожные слои нейлоновым швом. После обильного исследования отделите DRG вместе с нервными корешками и седалищным нервом, осторожно, с помощью микроножниц и микрощипцов под микроскопом для вскрытия.

Затем переведите седалищный нерв непосредственно в 4% PFA на ночь при температуре четыре градуса Цельсия. Чтобы визуализировать и измерить меченные флуоресценцией сенсорные аксоны под микроскопом для препарирования, осторожно снимите прикрепленную ткань и мембрану на неподвижном седалищном нерве с помощью микроножниц и микрощипцов. Затем промойте нерв с помощью ПВС три раза.

Далее поместите седалищный нерв на предметное стекло и держите его прямо. Добавьте 80 микролитров раствора против выцветания вокруг нерва, затем наложите на него покровную крышку. Расплющите всю смонтированную ткань с нажимом.

После этого поместите сплющенную ткань под инвертированный эпифлуоресцентный микроскоп, оснащенный аксессуаром для получения мозаики и обработки изображений. При измерении длины регенерированных аксонов проследите все идентифицируемые флуоресцентно меченые аксоны в седалищном нерве от места раздавливания до дистальных концов аксонов. При применении современного метода электропорации in-vivo для изучения регенерации аксонов седалищный нерв был сплющен и визуализирован.

Каждый регенерированный аксон с характерной траекторией и узнаваемым дистальным концом аксона может быть прослежен по месту раздавливания, обозначенному шовным узлом. Белый наконечник стрелы, стрелка и звезда указывают на три характерных конца аксона, каждый из которых простирается от места раздавливания. Кроме того, DRG были подвергнуты электропорации с помощью плазмид EGFP, и был собран спинной мозг.

Меченые EGFP аксоны дорсального столба в спинном мозге были визуализированы и идентифицированы как на продольном, так и на сагиттальном проекционных изображениях. Вот подробный вид аксонов в дорсальном столбе, а вот подробный вид аксонов в зоне входа в дорсальный корешок. На этом изображении показана сагиттальная проекция аксонов, меченных EGFP, в пределах дорсальной колонны.

В качестве альтернативы конфокальные изображения могут быть обработаны с помощью программного обеспечения для визуализации микроскопии для реконструкции 3D-изображения. Пытаясь выполнить эту процедуру, важно помнить о правильном расположении L4 и L5 DRG и сделать узел на твердой мозговой оболочке, не прокалывая седалищный нерв, при этом пометив место раздавливания шовным узлом. После своего развития этот метод открывает путь исследователям в области регенерации аксонов к изучению генов, необходимых для ПНС, естественной регенерации аксонов, или генов, которые могут способствовать дальнейшей регенерации у взрослых мышей in vivo.