В Vitro опухолевых клеток Rechallenge для прогнозирования оценки химерных антигена рецепторов Т-клеток противоопухолевые функции
27 февраля 2019 г.
Здесь мы описываем метод в пробирке совместно культуры рекурсивный вызов опухоли целевой T-клеткам, который позволяет для анализа Фенотипические и функциональной деятельности противоопухолевых Т-клеток.
Этот протокол обеспечивает долгосрочный, in vitro, функциональный метод для оценки рецептора химерного антигена, или CAR Т-клеток, через повторяющиеся проблемы опухолевых клеток. Этот метод является менее трудоемким, и менее трудоемким, чем in vivo CAR Т-клеток оценки функции при достижении точного представления истинной противоопухолевой эффективности. Этот метод in vitro обеспечивает высокую пропускную способность скрининга и дифференциации CAR Т-клеток противоопухоло опухолевой потенции.
Который имеет потенциальное применение для оценки клинической эффективности продуктов CAR T клеток. Начните с отсоциации опухолевых опухолей глиобластомы от культуры опухолевой глиобластомы. С одним миллилитров холодной accutase, и от 30 до 60 секунд пипетки.
Когда опухолевыесферы были нарушены, остановить реакцию с пятью миллилитров теплой со-культуры среды. И гранулы опухолевых клеток суспензии центрифугации. Повторное приостановление клеток глиобластомы в 1,6 раза от 10 до пятой опухолевых клеток на миллилитр свежей средней концентрации кокультуры, и разбавить Т-клеток, собранных из культуры Т-клеток ЦАР в соответствующий процент CAR положительные Т-клетки на миллилитр со-культуры средней концентрации.
Далее добавьте 100 микролитров разбавленных опухолевых клеток к каждому колодец из 96 хорошо плоской нижней пластины культуры ткани. И 100 микролитров Т-клеток CAR в каждый колодец опухолевых клеток с нежным смешиванием. Затем поместите пластину в 37 градусов по Цельсию, 5% углекислого газа инкубатора.
В дни два, четыре и шесть культуры, тщательно удалить 50 микролитров среды из каждого колодец опухолевой клетки, Т-клеток совместной культуры пластины намечено на rechallenge в соответствии с таблицей. Затем добавьте 50 микролитров свежей глиобластомной клеточной суспензии, подготовленной, как только что продемонстрировано, но с вдвое большим количеством клеток исходной ко-культуры к каждому хорошо с нежным смешиванием. И верните тарелку в инкубатор клеточной культуры.
Дни один, три, пять и семь со-культуры, передать supernatant из каждого хорошо, которые будут собраны в новый 96 хорошо круглой нижней пластины в соответствии с таблицей и добавить 50 микролитров предварительно разогретых 0,5%Трипсин EDTA в каждой среде истощены хорошо. После пяти минут при 37 градусах по Цельсию, подтвердите, что клетки отделились от нижней части каждой хорошо световой микроскопии, и осторожно пипетки фермента раствора вокруг нижней части каждой хорошо, чтобы повторно использовать клетки. Перед передачей отдельной клеточной подвески в соответствующие скважины новой пластины 96 скважин.
Пеллет клетки центрифугации, и мыть клетки с 200 микролитров флуоресцентных активированных клеток сортировки стоя решение, или FFS на колодец со второй центрифугации. Повторно приостанавливайте гранулы в 100 микролитров антитела коктейль интерес в 100 микролитров SSS на колодец в течение 30 минут инкубации при четырех градусах по Цельсию. Конец инкубации удаляет любые несыряемые антитела последовательными 100 и 200 микролитров FSS моет и повторно приостанавливает клетки в 100-200 микролитров ядерного пятна DAPI и FSS.
Затем проанализируйте клетки в соответствии со стандартными протоколами цитометрического анализа потока. Для функционального и фенотипического анализа Т-клеток CAR после совместной культуры опухолевых клеток, извлечения файлов данных из цитометра потока и ворот всех живых отрицательных клеток DAPI. Для количественной оценки опухолевых клеток, ворота CD45 отрицательной популяции.
Для количественной оценки ЦАР Т-клеток ворот CD45 положительный CAR положительной популяции. Затем участок опухоли и CAR Т-клеток номера в течение времени эксперимента, выявление активации Т-клеток по совместное выражение 41BB, и CD69. T-cell исчерпание по выражению PD1, LAG3 и TIM3, а также статус памяти Т-клеток LAG3, и TIM3, и статус памяти Т-клеток CD45RO, и CD62 лиганд выражение.
CD45RO и выражением лиганда CD62. Оба CD4 положительные, и CD8 положительные Т-клетки CAR становятся одинаково активированы против клеток глиобластомы, которые выражают целевой антиген, как указано в их CD107a и внутриклеточной цитокинов выражения. Однако, по оценке повторяющихся проблем с опухолью SA, CD4 положительный, но не CD8 положительный, CAR Т-клеток способны несколько круглых убийств.
CD4 положительные Т-клетки CAR также достичь более надежного расширения. Когда CD4 положительные, и CD8 положительные Т-клетки CAR смешиваются в соотношении один к одному, эта комбинация клеток из выполняет CD8 положительные, но не CD4 положительные клетки CAR T с точки зрения долгосрочной цитотоксичности. Кроме того, расширение CD8 положительные Т-клетки ЦАР индуцируется добавлением CD4 положительных Т-клеток.
В то время как CD4 положительное расширение Т-клеток CAR тормозится в присутствии положительных клеток CDa. Через 24 часа после первоначальной совместной культуры, как CD4 положительные, так и CD8 положительные Т-клетки CAR аналогичным образом активируются. Во время повторяющихся проблем опухоли, как CD4 положительные и CD8 положительные Т-клетки ЦАР демонстрируют переход от CD45RO положительный, CD62 лиган положительный фенотип центральной памяти, к CD45RO положительный CD62 лиган отрицательный фенотип памяти эффектора.
CD8 положительные Т-клетки CAR также более склонны к истощению по сравнению с CD4 положительные Т-клетки CAR, как оценивается их PD1, LAG3 и TIM3 выражение после трех дней совместной культуры. Кроме того, никаких различий, наблюдаемых в CDa положительное истощение Т-клеток CAR T в присутствии или отсутствии CD4 положительных Т-клеток, что свидетельствует о том, что CD4 индуцированных CD8 положительное расширение КЛЕТ Т-клеток НЕ связано с лучшей функцией эффектора. Это эссе также может быть соединено с сортировкой Т-клеток форме совместной культуры для выполнения дальнейшего анализа на транскриптомы, протеомика, и конкретные гены, представляющие интерес.
Эта повторяющаяся проблема опухоли также может быть использована в качестве платформы для расследования биологических событий после распознавания опухоли Т-клеток CAR.
Обзор
В данной статье представлен метод совместного культивирования in vitro для функциональной оценки CAR T-клеток путем повторных воздействий опухолевыми клетками. Этот подход позволяет провести детальный анализ активности Т-клеток в отношении клеток глиобластомы.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Иммунология
- Клеточная биология
- Исследования рака
Теоретические сведения
- Т-клетки с химерным антигенным рецептором (CAR) создаются с помощью генной инженерии для воздействия на специфические опухолевые антигены.
- Оценка эффективности CAR T-клеток традиционно требует использования сложных моделей in vivo.
- В данном исследовании представлен более простой метод in vitro для оценки функции CAR T-клеток.
- Понимание ответов Т-клеток имеет решающее значение для совершенствования методов иммунотерапии рака.
Цель исследования
- Разработка высокопроизводительного метода оценки противоопухолевой активности CAR T-клеток.
- Анализ фенотипических и функциональных характеристик CAR T-клеток при совместном культивировании с клетками глиобластомы.
- Изучение влияния повторных воздействий опухолевых клеток на активацию и истощение T-клеток.
Используемые методы
- Сокультивирование клеток глиобластомы и CAR-T клеток в 96-луночном планшете.
- Повторяющееся воздействие с постепенным увеличением количества опухолевых клеток в течение нескольких дней.
- Проточная цитометрия для оценки маркеров активации и истощения T-клеток.
- Количественный анализ популяций CAR-T клеток и опухолевых клеток на протяжении всего эксперимента.
Основные результаты
- CAR T-клетки как CD4+, так и CD8+ активируются против клеток глиобластомы.
- CAR T-клетки CD4+ демонстрируют более интенсивную экспансию и способны к многократным циклам уничтожения мишеней.
- CAR T-клетки CD8+ проявляют более выраженную тенденцию к истощению по сравнению с CAR T-клетками CD4+.
- Присутствие CAR T-клеток CD4+ усиливает экспансию CAR T-клеток CD8+.
Выводы
- Данный метод in vitro эффективно имитирует микроокружение опухоли для оценки CAR-T-клеток.
- Повторяющееся воздействие опухолевых клеток позволяет изучить динамику и эффективность T-клеток.
- Полученные результаты могут помочь в разработке стратегий по оптимизации терапии CAR-T-клетками в клинических условиях.
Часто задаваемые вопросы
Значимость для промышленности
Данный анализ повторного воздействия на опухолевые клетки in vitro восполняет критический пробел в разработке CAR-T-клеток, предоставляя прогностический высокопроизводительный метод оценки долгосрочной цитотоксической функции и пролиферативной способности при физиологически релевантных опухолевых нагрузках. Путем симуляции многократного воздействия антигена в течение семи дней данный анализ точнее отражает динамику противоопухолевого ответа in vivo, чем стандартные краткосрочные тесты на лизис, что позволяет раньше выявить риски, связанные с кандидатами в CAR-T-клетки. Это способствует принятию обоснованных решений о продолжении или прекращении разработки на этапах поиска и доклинических исследований, улучшая приоритизацию портфеля и снижая биологические риски на поздних стадиях.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранние этапы поиска и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет исследовать функциональную персистенцию CAR T-клеток и их потенциал к рекурсивному уничтожению при повторном воздействии опухоли.
- Научная ценность: способствует фенотипическому профилированию маркеров активации, истощения и памяти для снижения рисков при проверке гипотез о взаимодействии с мишенью.
- Практическая ценность: обеспечивает возможность параллельного сравнения продуктов CAR T-клеток CD4+ и CD8+ для выбора оптимальной конструкции.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: Позволяет получать количественные лонгитюдные данные о динамике совместного культивирования опухолевых клеток и Т-клеток во времени.
- Практическая ценность: Используется формат 96-луночного планшета, совместимый с высокопроизводительным скринингом нескольких вариантов CAR T-клеток.
- Практическая ценность: Требует только стандартного оборудования для проточной цитометрии, что обеспечивает широкое внедрение метода в исследовательских лабораториях.
Трансляционные и доклинические исследования
- Научная ценность: Отражает наблюдения in vivo, при которых CAR T-клетки CD4+ демонстрируют более интенсивную экспансию и устойчивую активность в ортотопических моделях GBM.
- Научная ценность: Связывает функциональные показатели in vitro с эффективностью in vivo, обеспечивая трансляционную преемственность.
- Практическая ценность: Позволяет снизить механистические риски путем выявления фенотипов, склонных к истощению (например, PD1, LAG3, TIM3 в CD8+ клетках), до проведения дорогостоящих исследований in vivo.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный анализ вписывается в континуум от поиска до доклинических исследований, служа функциональным связующим звеном между первоначальной идентификацией перспективного соединения и доклинической валидацией, обеспечивая раннюю прогностическую уверенность в эффективности и стабильности CAR-T клеток.
- Фундаментальная биология: обеспечивает проверку гипотез о персистенции и противоопухолевой функции CAR T-клеток после начальной активации.
- Скрининг: предоставляет воспроизводимые количественные данные совместного культивирования, позволяющие ранжировать продукты CAR T-клеток по их способности к рекурсивному уничтожению мишеней.
- Аналитика: предоставляет многопараметрические данные проточной цитометрии о фенотипах T-клеток и клиренсе опухоли для принятия решений на основе данных.
- Трансляционные исследования: демонстрирует корреляцию с результатами на ортотопических ксенографтах, подтверждая значимость метода для преклинической преемственности.
- Корпоративное использование: создает стандартизированную, многократно используемую платформу для постоянной оценки продуктов CAR T-клеток в рамках различных программ.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Прогностическая уверенность в долгосрочной противоопухолевой функции и снижение механистической неопределенности эффективности CAR-T клеток.
- Операционная ценность: Стандартизированный, масштабируемый рабочий процесс с минимальным временем непосредственного участия оператора по сравнению с моделями in vivo.
- Стратегическая ценность: Повышение эффективности использования капитала за счет возможности раннего выявления высокопотенциальных кандидатов CAR-T клеток.
- Влияние на портфель: Приоритизация с поправкой на риск на основе валидированного пролиферативного и цитотоксического потенциала.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы с первичными культурами иммунных клеток, методами стерильного совместного культивирования и проточной цитометрией.
- Необходимо наличие доступа к проточному цитометру, поддерживающему многопараметрическое иммунофенотипирование (например, CD45, CAR, CD69, 41BB, PD1, LAG3, TIM3, CD45RO, CD62L).
- Требуется стандартизированная подготовка опухолевых клеток (например, туморосфер глиобластомы) и строгое соблюдение графика повторного введения клеток каждые 48 часов.
- Адаптация метода к другим моделям опухолей может потребовать оптимизации экспрессии антигенов и устойчивости опухолевых клеток к повторному воздействию.
- Продолжительность анализа (7 дней) и этапы замены среды требуют тщательного планирования и контроля стерильности для предотвращения контаминации.
Часто задаваемые вопросы по биофармацевтике
Chapters in this video
0:04
Title
0:54
Tumor Cell: T Cell Co-culture Setup and Tumor Cell Rechallenge
2:37
Sample Harvest for Flow Cytometric Analysis
4:12
Functional and Phenotypic Chimeric Antigen Receptor (CAR) T Cell Analysis
5:14
Results: Representative CD4+ and CD8+ CAR T Cell Phenotypes After Repetitive Challenge
7:30
Conclusion
