В Vitro опухолевых клеток Rechallenge для прогнозирования оценки химерных антигена рецепторов Т-клеток противоопухолевые функции

Этот протокол обеспечивает долгосрочный, in vitro, функциональный метод для оценки рецептора химерного антигена, или CAR Т-клеток, через повторяющиеся проблемы опухолевых клеток. Этот метод является менее трудоемким, и менее трудоемким, чем in vivo CAR Т-клеток оценки функции при достижении точного представления истинной противоопухолевой эффективности. Этот метод in vitro обеспечивает высокую пропускную способность скрининга и дифференциации CAR Т-клеток противоопухоло опухолевой потенции.

Который имеет потенциальное применение для оценки клинической эффективности продуктов CAR T клеток. Начните с отсоциации опухолевых опухолей глиобластомы от культуры опухолевой глиобластомы. С одним миллилитров холодной accutase, и от 30 до 60 секунд пипетки.

Когда опухолевыесферы были нарушены, остановить реакцию с пятью миллилитров теплой со-культуры среды. И гранулы опухолевых клеток суспензии центрифугации. Повторное приостановление клеток глиобластомы в 1,6 раза от 10 до пятой опухолевых клеток на миллилитр свежей средней концентрации кокультуры, и разбавить Т-клеток, собранных из культуры Т-клеток ЦАР в соответствующий процент CAR положительные Т-клетки на миллилитр со-культуры средней концентрации.

Далее добавьте 100 микролитров разбавленных опухолевых клеток к каждому колодец из 96 хорошо плоской нижней пластины культуры ткани. И 100 микролитров Т-клеток CAR в каждый колодец опухолевых клеток с нежным смешиванием. Затем поместите пластину в 37 градусов по Цельсию, 5% углекислого газа инкубатора.

В дни два, четыре и шесть культуры, тщательно удалить 50 микролитров среды из каждого колодец опухолевой клетки, Т-клеток совместной культуры пластины намечено на rechallenge в соответствии с таблицей. Затем добавьте 50 микролитров свежей глиобластомной клеточной суспензии, подготовленной, как только что продемонстрировано, но с вдвое большим количеством клеток исходной ко-культуры к каждому хорошо с нежным смешиванием. И верните тарелку в инкубатор клеточной культуры.

Дни один, три, пять и семь со-культуры, передать supernatant из каждого хорошо, которые будут собраны в новый 96 хорошо круглой нижней пластины в соответствии с таблицей и добавить 50 микролитров предварительно разогретых 0,5%Трипсин EDTA в каждой среде истощены хорошо. После пяти минут при 37 градусах по Цельсию, подтвердите, что клетки отделились от нижней части каждой хорошо световой микроскопии, и осторожно пипетки фермента раствора вокруг нижней части каждой хорошо, чтобы повторно использовать клетки. Перед передачей отдельной клеточной подвески в соответствующие скважины новой пластины 96 скважин.

Пеллет клетки центрифугации, и мыть клетки с 200 микролитров флуоресцентных активированных клеток сортировки стоя решение, или FFS на колодец со второй центрифугации. Повторно приостанавливайте гранулы в 100 микролитров антитела коктейль интерес в 100 микролитров SSS на колодец в течение 30 минут инкубации при четырех градусах по Цельсию. Конец инкубации удаляет любые несыряемые антитела последовательными 100 и 200 микролитров FSS моет и повторно приостанавливает клетки в 100-200 микролитров ядерного пятна DAPI и FSS.

Затем проанализируйте клетки в соответствии со стандартными протоколами цитометрического анализа потока. Для функционального и фенотипического анализа Т-клеток CAR после совместной культуры опухолевых клеток, извлечения файлов данных из цитометра потока и ворот всех живых отрицательных клеток DAPI. Для количественной оценки опухолевых клеток, ворота CD45 отрицательной популяции.

Для количественной оценки ЦАР Т-клеток ворот CD45 положительный CAR положительной популяции. Затем участок опухоли и CAR Т-клеток номера в течение времени эксперимента, выявление активации Т-клеток по совместное выражение 41BB, и CD69. T-cell исчерпание по выражению PD1, LAG3 и TIM3, а также статус памяти Т-клеток LAG3, и TIM3, и статус памяти Т-клеток CD45RO, и CD62 лиганд выражение.

CD45RO и выражением лиганда CD62. Оба CD4 положительные, и CD8 положительные Т-клетки CAR становятся одинаково активированы против клеток глиобластомы, которые выражают целевой антиген, как указано в их CD107a и внутриклеточной цитокинов выражения. Однако, по оценке повторяющихся проблем с опухолью SA, CD4 положительный, но не CD8 положительный, CAR Т-клеток способны несколько круглых убийств.

CD4 положительные Т-клетки CAR также достичь более надежного расширения. Когда CD4 положительные, и CD8 положительные Т-клетки CAR смешиваются в соотношении один к одному, эта комбинация клеток из выполняет CD8 положительные, но не CD4 положительные клетки CAR T с точки зрения долгосрочной цитотоксичности. Кроме того, расширение CD8 положительные Т-клетки ЦАР индуцируется добавлением CD4 положительных Т-клеток.

В то время как CD4 положительное расширение Т-клеток CAR тормозится в присутствии положительных клеток CDa. Через 24 часа после первоначальной совместной культуры, как CD4 положительные, так и CD8 положительные Т-клетки CAR аналогичным образом активируются. Во время повторяющихся проблем опухоли, как CD4 положительные и CD8 положительные Т-клетки ЦАР демонстрируют переход от CD45RO положительный, CD62 лиган положительный фенотип центральной памяти, к CD45RO положительный CD62 лиган отрицательный фенотип памяти эффектора.

CD8 положительные Т-клетки CAR также более склонны к истощению по сравнению с CD4 положительные Т-клетки CAR, как оценивается их PD1, LAG3 и TIM3 выражение после трех дней совместной культуры. Кроме того, никаких различий, наблюдаемых в CDa положительное истощение Т-клеток CAR T в присутствии или отсутствии CD4 положительных Т-клеток, что свидетельствует о том, что CD4 индуцированных CD8 положительное расширение КЛЕТ Т-клеток НЕ связано с лучшей функцией эффектора. Это эссе также может быть соединено с сортировкой Т-клеток форме совместной культуры для выполнения дальнейшего анализа на транскриптомы, протеомика, и конкретные гены, представляющие интерес.

Эта повторяющаяся проблема опухоли также может быть использована в качестве платформы для расследования биологических событий после распознавания опухоли Т-клеток CAR.